ФИКСАЦИЯ АТМОСФЕРНОГО АЗОТА IN VITRO ФЕРМЕНТНЫМИ ПРЕПАРАТАМИ, ВЫДЕЛЕННЫМИ ИЗ КЛУБЕНЬКОВ БОБОВЫХ И ИЗ НЕИНФИЦИРОВАННЫХ БАКТЕРИЯМИ ВЫСШИХ РАСТЕНИ

[33]

Изучение механизма биохимической фиксации азота в живой клетке сопряжено с труднопреодолимыми препятствиями вследствие быстрого включения фиксированного азота в общий метаболизм клетки.

В проведенных нами ранее исследованиях по симбиотической фиксации азота бобовыми [6] было найдено, что в первые часы экспозиции бобовых в атмосфере N^5, меченый азот обнаруживался в больших количествах в клеточном соке клубеньковой ткани и совершенно отсутствовал в выделенных из клубеньков бактериальных клетках Rhizobium. Отсюда следовало, что фиксация азота локализована не внутри бактериальных клеток, а в клубеньковых структурах, образование которых индуцировано вторжением в корни бобовых растений бактерий Rhizobium. Это побудило нас начать работы по выделению и изучению азотфиксирующих ферментов, присутствующих в клу

беньках бобовых растений. В результате были разработаны следующие методы.

Отделенные от корней бобовых клубеньки замораживались жидким азотом и затем измельчались. Тонкоизмельченная масса клубеньков использовалась для иззлечения азотфикси- рующего фермента непосредственно или предварительно экстрагировалась ацетоном до полного обезвоживания и затем экстрагировалась эфиром. В последнем случае получался порошковый продукт, который потом использовался для извлечения фермента.

Измельченные клубеньки или полученный из них сухой порошок обрабатывались в течение 20 минут фосфатным буфером pH 6,8 с добавкой аскорбиновой кислоты, центрифугировались на суперцентрифуге с охлаждением в течение 15 минут при 10 000—12 000 g, и надцентрифужная жидкость, свободная от обломков тканей и клеток, использовалась для выделения фермента. Для этого к ней добавлялся насыщенный раствор сульфата магния с таким расчетом, чтобы содержание MgS04-7H20 в жидкости составляло около 30%. В этих условиях выпадает тонкий осадок белка (фермент А), который отделяется от раствора центрифугированием. В ряде опытов фермент А подвергался диализу против дистиллированной воды до полного удаления иона магния. Выход фермента очень мал: из 3 г сухой массы клубеньков люпина получалось 2,5— 4,5 мг отдиализованного препарата фермента с абсолютным содержанием азота 0,4—0,7 мг. При кислотном гидролизе этого препарата в гидролизате хроматографическим методом были обнаружены аспарагиновая и глутаминовая’ кислоты, аланин, глицин, треонин, серин, метионин, валин, тирозин, триптофан, фенилаланин. Этот препарат фермента на данной стадии разработки нужно рассматривать не как чистый, индивидуальный фермент, а только как смесь белков, в составе которых представлен и азотфиксирующий фермент.

Кроме такого метода, применялся и другой — экстрагирование измельченной сухой массы клубеньков водным 60%-ным этиловым спиртом; полученный экстракт использовался в опытах в качестве источников азотфиксирующего фермента. Испытания активности выделенных препаратов производились в герметической камере в атмосфере, обогащенной N?,5.

Препарат фермента, охлажденный до 0°С, буфер и добавки активаторов вводились в камеру, из нее эвакуировался воздух до остаточного давления 100 мм рт. ст., а затем камера заполнялась до 1 атм. газообразным азотом, обогащенным изотопом N15. Обычно обогащение атмосферы в* камере изотопом N15 (Z) было близким к 11,5, если принять за единицу содержание изотопа N15 в природном азоте. Камера помещалась в термостат с постоянной температурой 35°С. Во время опыта при помощи специального аппарата, установленного в термостате, камера непрерывно встряхивалась, что обеспечивало более интенсивный контакт фермента с атмосферой камеры. По окончании опыта содержимое камеры переносилось в колбу, куда добавлялось несколько миллилитров раствора NaOH, и отгонялся аммиак, находившийся в системе в виде аммонийных соединений, а также трансформированный аммиак, представленный в системе амидными группами глутамина и аспарагина. Отгоняемый аммиак улавливался 0,1 н. H2S04y окис-, лялся в вакууме (10_6) гипобромитом натрия до элементарного азота, а затем определялся его изотопный состав на масс-спектрометре. В ряде опытов определялось также содержание азота и его изотопный состав в остатке после отгона аммонийного и амидного азота. В таблицах 1 и 2 приведены данные, характеризующие активность отдельных ферментных препаратов.

Меченый азот включался в значительных количествах в состав аммонийной и амидной фракций. Включение N15 в остаточную фракцию азота (аминокислоты и белок) в течение 30-минутной экспозиции не происходило или происходило в ограниченных размерах.

Таким образом, выделенные препараты фермента катализируют in vitro фиксацию атмосферного азота с образованием аммиака в качестве конечного неорганического продукта фиксации. Неизмельченные клубеньки, изолированные от корней люпина за 24 часа до опыта, и взвесь* бактерий Rhizobium, выделенных из клубеньков люпина, не фиксировали азота. Удельная активность фермента обычно выражается числом оборотов, т. е. числом молей субстрата (в данном случае N2), прореагировавшего за 1 минуту с одним молем фермента. Для тех случаев, когда молекулярный вес фермента неизвестен, его принимают за 100 000.

Следует отметить, что максимальное количество фиксированного азота в опытах Карнагана и в опытах Берриеа и Вильсона достигало 244 fir на 100 мг белка при экспозиции в атмосфере N215 в течение 30 минут (Карнаган), что соответствует удельной активности, т. е. примерно в 170 раз меньше, чем у выделенных нами препаратов ферментов А (табл. 2).

Клубеньки бобовых представляют систему, включающую бактериальные клетки Rhizobium и перерожденную ткань высшего растения. Необходимо было установить, в какой части

Фиксация атмосферного азота препаратами ферментов, выделенных из клубеньков люпина

Примечание. Количество фиксированного азота вычислялось по фор- (Z — 1) • 100 X С

муле: —(Za — 1) Л00—* где ^^—обогащение N15 исследуемого препарата азота, (Za—1)—обогащение N15 азота атмосферы, С — содержание азота в исследуемом препарате, (лг.

этой системы продуцируются азотфиксирующие ферменты. Известно, что бактерии, изолированные от высшего растения, не могут фиксировать азот. Это было показано на огромном экспериментальном материале еще Аллисоном [7] и следует также из наших опытов. Не фиксируют азот и не инфицированные клубеньковыми бактериями бобовые растения. Но казалось невероятно, чтобы азотфиксирующие ферменты могли спонтанно заново возникнуть в клубеньках. Исходя из представлений о ферментах как специфических белках, природа которых определяется генами, присутствующими в хромосомах организма,, следовало сделать заключение о наличии преобразованных азотфиксирующих ферментов или в высшем растении, или в бактериях. Причем ферменты эти представлены неактивной формой или обратимо инактивированы каким-то ингибитором. Если

Удельная активность препарата фермента А, выделенного 1лз клубеньков люпина. Экспозиция препарата 15 минут в атмосфере, обогащенной N^5 (Z = 11,5)

допустить, что такой неактивный фермент присутствует в высшем растении, то превращение его ,в активную форму в результате вторжения бактерий Rhizobium в ткань высшего растения может оказаться возможным благодаря выделениям бактериями активирующих веществ или веществ, снимающих эффект ингибитора. Применяя описанные выше методы, нам удалось выделить соответствующие препараты из корней и листьев бобовых растений и из клеток клубеньковых бактерий.

Таблица 3

Фиксация атмосферного азота препаратами ферментов, выделенных из корней и листьев люпина и из бактериальных клеток Phizobiun trifolii. Экспозиция 30 минут в атмосфере, обогащенной N^5 (Z = 11,5)

Таким образом, и в неинфицированных корнях и листьях люпина, и в клубеньковых бактериях присутствуют ферменты, которые, будучи соответствующими приемами выделены из этих объектов, могут in vitro фиксировать свободный азот атмосферы. Возникает вопрос, присутствуют ли скрытые ферментные азотфиксирующие системы в других растениях, которые не способны к фиксации азота. Постановка такого вопроса кажется тем более оправданной еще и потому, что способностью к фиксации азота обладают не только избранные в'иды отдельных растений, но и, как показал,и Бонд [7], Гарднер и Бондов],, такие растения, как ольха, вереск, болотный мирт и некоторые другие, имеющие на своих корнях клубеньковые структуры, образованные совершенно различными организмами (миксомице- тами, грибами, плазмодием), также способны к фиксации азота.. В таблице 4 приведены результаты испытаний активности препаратов фермента А, выделенных из листьев некоторых небобовых растений.

Таблица Ф

Фиксация атмосферного азота ферментными препаратами, выделенными из листьев небобовых растений. Экспозиция 30 минут в атмосфере, обогащенной N215 (Z = 11,5)

Итак, ферментные препараты, выделенные из этих небобовых растений, в. условиях описанных опытов могут фиксировать азот. По-видимому, и в других небобовых растениях присутствуют в неактивном состоянии азотфиксирующие ферменты,, и, может быть, когда-нибудь удастся найти такие методы воздействия на растения, которые приведут в движение этот механизм и заставят его фиксировать атмосферный азот.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бах А. Н., Ермольева 3. В., Степаны а н М. П., ДАН, 1, 1934.
2. Roberggt;M. Jahrb. f. Wiss. Bot 83, 567, 1936.
3. Burris R. H., Eppling F. G. el al. Y. Biol. Chem. 148, Ж, 1943.

4. С а г n a h a n I. Е., М о г t е n s о n L. Е. et al. Bioch et Biophys acta. 44, 520, 1960.
5. Schneider К. C., Bradbeer C. el al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 46,

5. 726, 1960.

6. Турчин Ф. В. «Почвоведение» № 10, 1959.
7. Bond G. Advancoment, Sci. 15, 60, 382, 1959.
8. Gardner I. C., Bond G. Canad. Y. Bot. 35, 305, 1957.'