<<
>>

ФИКСАЦИЯ АТМОСФЕРНОГО АЗОТА IN VITRO ФЕРМЕНТНЫМИ ПРЕПАРАТАМИ, ВЫДЕЛЕННЫМИ ИЗ КЛУБЕНЬКОВ БОБОВЫХ И ИЗ НЕИНФИЦИРОВАННЫХ БАКТЕРИЯМИ ВЫСШИХ РАСТЕНИ

[33]

Изучение механизма биохимической фиксации азота в живой клетке сопряжено с труднопреодолимыми препятствиями вследствие быстрого включения фиксированного азота в общий метаболизм клетки. Не вызывает сомнений, что в раскрытии этого механизма был достигнут значительно большой прогресс, если бы ферментные системы, ответственные за фиксацию азота, могли быть изолированы от клетки. Попытки выделения азот- фиксирующих ферментов впервые были предприняты А. Н. Бахом, 3. В. Ермольевой и М.

Н. Степаниан [1], в работе которых сообщалось о фиксации азота в препаратах сока, отжатого из растертых клеток Azotobacter chroococum. Однако проведенные в дальнейшем исследования не привели к положительным результатам. В 1960 г. Карнаганом с сотрудниками [4] был разработан метод извлечения из анаэробных азотофиксирую- тц'их бактерий Clostridium Pasterianum свободного от клеток экстракта, обладающего способностью к фиксации азота. Почти одновременно такой же метод был использован Беррисом и Вильсоном с сотрудниками [3, 5] для получения активных экстрактов из клеток как Cl. Pasterianum, так и другой азотфикси- рующей бактерии Rhodospirillum rubrum.

В проведенных нами ранее исследованиях по симбиотической фиксации азота бобовыми [6] было найдено, что в первые часы экспозиции бобовых в атмосфере N^5, меченый азот обнаруживался в больших количествах в клеточном соке клубеньковой ткани и совершенно отсутствовал в выделенных из клубеньков бактериальных клетках Rhizobium. Отсюда следовало, что фиксация азота локализована не внутри бактериальных клеток, а в клубеньковых структурах, образование которых индуцировано вторжением в корни бобовых растений бактерий Rhizobium. Это побудило нас начать работы по выделению и изучению азотфиксирующих ферментов, присутствующих в клу

беньках бобовых растений. В результате были разработаны следующие методы.

Отделенные от корней бобовых клубеньки замораживались жидким азотом и затем измельчались. Тонкоизмельченная масса клубеньков использовалась для иззлечения азотфикси- рующего фермента непосредственно или предварительно экстрагировалась ацетоном до полного обезвоживания и затем экстрагировалась эфиром. В последнем случае получался порошковый продукт, который потом использовался для извлечения фермента.

Измельченные клубеньки или полученный из них сухой порошок обрабатывались в течение 20 минут фосфатным буфером pH 6,8 с добавкой аскорбиновой кислоты, центрифугировались на суперцентрифуге с охлаждением в течение 15 минут при 10 000—12 000 g, и надцентрифужная жидкость, свободная от обломков тканей и клеток, использовалась для выделения фермента. Для этого к ней добавлялся насыщенный раствор сульфата магния с таким расчетом, чтобы содержание MgS04-7H20 в жидкости составляло около 30%. В этих условиях выпадает тонкий осадок белка (фермент А), который отделяется от раствора центрифугированием. В ряде опытов фермент А подвергался диализу против дистиллированной воды до полного удаления иона магния. Выход фермента очень мал: из 3 г сухой массы клубеньков люпина получалось 2,5— 4,5 мг отдиализованного препарата фермента с абсолютным содержанием азота 0,4—0,7 мг. При кислотном гидролизе этого препарата в гидролизате хроматографическим методом были обнаружены аспарагиновая и глутаминовая’ кислоты, аланин, глицин, треонин, серин, метионин, валин, тирозин, триптофан, фенилаланин. Этот препарат фермента на данной стадии разработки нужно рассматривать не как чистый, индивидуальный фермент, а только как смесь белков, в составе которых представлен и азотфиксирующий фермент.

Кроме такого метода, применялся и другой — экстрагирование измельченной сухой массы клубеньков водным 60%-ным этиловым спиртом; полученный экстракт использовался в опытах в качестве источников азотфиксирующего фермента. Испытания активности выделенных препаратов производились в герметической камере в атмосфере, обогащенной N?,5. Было найдено, что азотфиксирующая активность препаратов фермента заметно повышается при добавлении некоторых веществ, могу* щих служить в качестве активаторов фермента, переносчиков водорода, акцепторов продуктов ферментативного синтеза и источника энергии. В качестве таких веществ применялись магний, молибден, биотин, пируват, аскорбиновая кислота, АТФ. Все добавки вводились в камеру в буферном фосфатном растворе pH 6,8 при общем объеме жидкости 35— 40 мл.

Препарат фермента, охлажденный до 0°С, буфер и добавки активаторов вводились в камеру, из нее эвакуировался воздух до остаточного давления 100 мм рт. ст., а затем камера заполнялась до 1 атм. газообразным азотом, обогащенным изотопом N15. Обычно обогащение атмосферы в* камере изотопом N15 (Z) было близким к 11,5, если принять за единицу содержание изотопа N15 в природном азоте. Камера помещалась в термостат с постоянной температурой 35°С. Во время опыта при помощи специального аппарата, установленного в термостате, камера непрерывно встряхивалась, что обеспечивало более интенсивный контакт фермента с атмосферой камеры. По окончании опыта содержимое камеры переносилось в колбу, куда добавлялось несколько миллилитров раствора NaOH, и отгонялся аммиак, находившийся в системе в виде аммонийных соединений, а также трансформированный аммиак, представленный в системе амидными группами глутамина и аспарагина. Отгоняемый аммиак улавливался 0,1 н. H2S04y окис-, лялся в вакууме (10_6) гипобромитом натрия до элементарного азота, а затем определялся его изотопный состав на масс-спектрометре. В ряде опытов определялось также содержание азота и его изотопный состав в остатке после отгона аммонийного и амидного азота. В таблицах 1 и 2 приведены данные, характеризующие активность отдельных ферментных препаратов.

Меченый азот включался в значительных количествах в состав аммонийной и амидной фракций. Включение N15 в остаточную фракцию азота (аминокислоты и белок) в течение 30-минутной экспозиции не происходило или происходило в ограниченных размерах.

Таким образом, выделенные препараты фермента катализируют in vitro фиксацию атмосферного азота с образованием аммиака в качестве конечного неорганического продукта фиксации. Неизмельченные клубеньки, изолированные от корней люпина за 24 часа до опыта, и взвесь* бактерий Rhizobium, выделенных из клубеньков люпина, не фиксировали азота. Удельная активность фермента обычно выражается числом оборотов, т. е. числом молей субстрата (в данном случае N2), прореагировавшего за 1 минуту с одним молем фермента. Для тех случаев, когда молекулярный вес фермента неизвестен, его принимают за 100 000.

Следует отметить, что максимальное количество фиксированного азота в опытах Карнагана и в опытах Берриеа и Вильсона достигало 244 fir на 100 мг белка при экспозиции в атмосфере N215 в течение 30 минут (Карнаган), что соответствует удельной активности, т. е. примерно в 170 раз меньше, чем у выделенных нами препаратов ферментов А (табл. 2).

Клубеньки бобовых представляют систему, включающую бактериальные клетки Rhizobium и перерожденную ткань высшего растения. Необходимо было установить, в какой части

Фиксация атмосферного азота препаратами ферментов, выделенных из клубеньков люпина

Сумма аммонийного и амидного азота в конце опыта

Азот остатка после отгона аммонийного и амидного азота

Препараты

С-

?

обогащение изотопом N15, Z

фиксировано N,

[АГ

N, мг

обогащение изотопом N15, Z

фиксировано N ;хг

Фермент А из свежезамороженных клубеньков

1,06

6,62

564

0,78

1,04

0,0

люпина

1,15

7,56

720'

Фермент А из сухой массы клубеньков люпина, обработанных ацетоном и эфиром

0,64

6,07

310

Ю,45

1,03

0,0

Фермент А из клубеньков люпина, хранившихся в замороженном виде 20 дней

0,70

3,65

176

3,66

1,37

130

Спиртовой экстракт из сухой массы клубеньков люпина, обработанных ацетоном и эфиром

4,62

3,03

892

3,11

1,03

0,0

Цельные клубеньки через 24 часа после отделения от корней люпина

2,03

1,02

0,0

Бактерии Rhizobium, выделенные из свежих клубеньков люпина

2,1

1,02

0,0

Примечание. Количество фиксированного азота вычислялось по фор- (Z — 1) • 100 X С

муле: —(Za — 1) Л00—* где ^^—обогащение N15 исследуемого препарата азота, (Za—1)—обогащение N15 азота атмосферы, С — содержание азота в исследуемом препарате, (лг.


этой системы продуцируются азотфиксирующие ферменты. Известно, что бактерии, изолированные от высшего растения, не могут фиксировать азот. Это было показано на огромном экспериментальном материале еще Аллисоном [7] и следует также из наших опытов. Не фиксируют азот и не инфицированные клубеньковыми бактериями бобовые растения. Но казалось невероятно, чтобы азотфиксирующие ферменты могли спонтанно заново возникнуть в клубеньках. Исходя из представлений о ферментах как специфических белках, природа которых определяется генами, присутствующими в хромосомах организма,, следовало сделать заключение о наличии преобразованных азотфиксирующих ферментов или в высшем растении, или в бактериях. Причем ферменты эти представлены неактивной формой или обратимо инактивированы каким-то ингибитором. Если

Удельная активность препарата фермента А, выделенного 1лз клубеньков люпина. Экспозиция препарата 15 минут в атмосфере, обогащенной N^5 (Z = 11,5)

Опыт I

Опыт II

Вес препарата фермента (белка), мг

2,5

1,6

Аммиачный и амидный азот в конце опыта, мг

1,06

1,7

Обогащение (Z) изотопом N15

6,62

4,12

Фиксировано меченого азота атмосферы, jxr

570

320

Удельная активность фермента

55 .

48

допустить, что такой неактивный фермент присутствует в высшем растении, то превращение его ,в активную форму в результате вторжения бактерий Rhizobium в ткань высшего растения может оказаться возможным благодаря выделениям бактериями активирующих веществ или веществ, снимающих эффект ингибитора. Применяя описанные выше методы, нам удалось выделить соответствующие препараты из корней и листьев бобовых растений и из клеток клубеньковых бактерий. Результаты испытания азотфиксирующей активности этих препаратов приведены в таблице 3.

Таблица 3

Фиксация атмосферного азота препаратами ферментов, выделенных из корней и листьев люпина и из бактериальных клеток Phizobiun trifolii. Экспозиция 30 минут в атмосфере, обогащенной N^5 (Z = 11,5)

Препарат ферментов

Сумма аммонийного и амидного азота в конце опыта, мг

Обогащение изотопом N15 (Z)

Фиксировано N, ^г

Фермент А, выделенный из корней люпина

1,12

2,43

152

Фермент А, выделенный из высушенных листьев люпина

1,12

4,02

318

Фермент’А, выделенный из свежезамороженных и обработанных ацетоном и эфиром листьев люпина

1,14

5,03

451

Спиртовой экстракт из свежезамороженных и обработанных ацетоном и эфиром листьев люпина

1,68

5,03

677

Фермент А, выделенный из чистых культур бактерий Rhizobium trifolii, штамм 225

1,54

3,35

344

Спиртовой экстракт, выделенный из чистых культур бактерий Rhizobium trifolii штамм 225

0,98

5,55

425

Таким образом, и в неинфицированных корнях и листьях люпина, и в клубеньковых бактериях присутствуют ферменты, которые, будучи соответствующими приемами выделены из этих объектов, могут in vitro фиксировать свободный азот атмосферы. Возникает вопрос, присутствуют ли скрытые ферментные азотфиксирующие системы в других растениях, которые не способны к фиксации азота. Постановка такого вопроса кажется тем более оправданной еще и потому, что способностью к фиксации азота обладают не только избранные в'иды отдельных растений, но и, как показал,и Бонд [7], Гарднер и Бондов],, такие растения, как ольха, вереск, болотный мирт и некоторые другие, имеющие на своих корнях клубеньковые структуры, образованные совершенно различными организмами (миксомице- тами, грибами, плазмодием), также способны к фиксации азота.. В таблице 4 приведены результаты испытаний активности препаратов фермента А, выделенных из листьев некоторых небобовых растений.

Таблица Ф

Фиксация атмосферного азота ферментными препаратами, выделенными из листьев небобовых растений. Экспозиция 30 минут в атмосфере, обогащенной N215 (Z = 11,5)

Растения

Метод выделения ферментного препарата

Сумма аммонийного и амидного азота в конце опыта, мг

Обогащение изотопом N15, Z

Фиксировано азота, [аг

Озимая рожь (зеленая масса)

Фермент А

2,81

3,01

540

Береза (листья)

0,84

4,63

290

Шиповник (листья)

4,83

2,99

910

Тимофеевка (зеленая масса)

1,26

1,92

110

Бегония (листья)

0,70

5,42

295

Пшеница (зеленая масса)

0,75

2,89

135

Овес (зеленая масса)

Спиртовой

1,31

2,72

214

Табак (листья)

экстракт

4,2

3,51

1010

Итак, ферментные препараты, выделенные из этих небобовых растений, в. условиях описанных опытов могут фиксировать азот. По-видимому, и в других небобовых растениях присутствуют в неактивном состоянии азотфиксирующие ферменты,, и, может быть, когда-нибудь удастся найти такие методы воздействия на растения, которые приведут в движение этот механизм и заставят его фиксировать атмосферный азот.

ЛИТЕРАТУРА

  1. Бах А. Н., Ермольева 3. В., Степаны а н М. П., ДАН, 1, 1934.
  2. Roberggt;M. Jahrb. f. Wiss. Bot 83, 567, 1936.
  3. Burris R. H., Eppling F. G. el al. Y. Biol. Chem. 148, Ж, 1943.

  1. С а г n a h a n I. Е., М о г t е n s о n L. Е. et al. Bioch et Biophys acta. 44, 520, 1960.
  2. Schneider К. C., Bradbeer C. el al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 46,
  1. 726, 1960.
  1. Турчин Ф. В. «Почвоведение» № 10, 1959.
  2. Bond G. Advancoment, Sci. 15, 60, 382, 1959.
  3. Gardner I. C., Bond G. Canad. Y. Bot. 35, 305, 1957.'

<< | >>
Источник: Турчин Федор Васильевич. АЗОТНОЕ ПИТАНИЕ РАСТЕНИЙ И ПРИМЕНЕНИЕ АЗОТНЫХ УДОБРЕНИЙ. Избранные труды. М., «Колос», 336 с. с ил.. 1972

Еще по теме ФИКСАЦИЯ АТМОСФЕРНОГО АЗОТА IN VITRO ФЕРМЕНТНЫМИ ПРЕПАРАТАМИ, ВЫДЕЛЕННЫМИ ИЗ КЛУБЕНЬКОВ БОБОВЫХ И ИЗ НЕИНФИЦИРОВАННЫХ БАКТЕРИЯМИ ВЫСШИХ РАСТЕНИ:

  1. НОВЫЕ ДАННЫЕ О МЕХАНИЗМЕ ФИКСАЦИИ АТМОСФЕРНОГО АЗОТА В КЛУБЕНЬКАХ БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ [31]
  2. РАСТИТЕЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ IN VITRO ДЛЯ ТЕСТИРОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ ИЗ ТОРФА О.              А. Рожанская
  3. Биологическая фиксация азота
  4. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АЗОТА, ФОСФОРА И КАЛИЯ В ПИТАНИИ РАСТЕНИЙ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ИМИ НИТРАТНЫХ И АММОНИЙНЫХ ФОРМ АЗОТА [22]
  5. ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКАИ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТАБОЛИТОВ,ОБЛАДАЮЩИХ ФУНГИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ,ПРОДУЦИРУЕМЫХ БАКТЕРИЯМИ РОДОВ PSEUDOMONASИ AZOTOBACTER
  6. О СКОРОСТИ ОБНОВЛЕНИЯ БЕЛКА И ХЛОРОФИЛЛА В ВЫСШИХ РАСТЕНИЯХ [24]
  7. Е. В. Сергиевская. Систематика высших растений. Практический курс, 1998
  8. Теория вида у высших растений
  9. Симптомы, вызванные неподходящей для данного растения атмосферной влажностью
  10. Характеристика выделенных культур по наличию свойств,положительно влияющих на растение
  11. ИССЛЕДОВАНИЕ АЗОТНОГО ОБМЕНА РАСТЕНИЙ С ПРИМЕНЕНИЕМ ИЗОТОПОВ АЗОТА N15 [27]
  12. БАКТЕРИИ РОДОВ PSEUDOMONAS И AZOTOBACTER -АНТАГОНИСТЫ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВИ БАКТЕРИЙ
  13. ВЛИЯНИЕ КАЛИЙНО-ФОСФАТНОГО ФОНА НА ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РАСТЕНИЯМИ АММИАЧНЫХ И НИТРАТНЫХ ФОРМ АЗОТА[18]
  14. Вредители бобовых