ИССЛЕДОВАНИЕ АЗОТНОГО ОБМЕНА РАСТЕНИЙ С ПРИМЕНЕНИЕМ ИЗОТОПОВ АЗОТА N15 [27]

Прикенение стабильного изотопа азота N15 в биохимических исследованиях имеет то неоспоримое преимущество перед радиоактивными индикаторами, что он по сво.ему действию на живой организм в любой концентрации ничем не отличается от обычного азота.

Применяя обычные химические методы анализа растении, мы часто не обнаруживаем закономерных изменений в количественном содержании отдельных азотистых веществ в растениях на протяжении какого-то промежутка времени.

Так, например, в одном из наших опытов с молодыми растениями овса через 24 часа после внесения азотной подкормки с 5-кратным обогащением N15 общее содержание* аминокислотного азота составляло 75 мг на 100 г сырой зеленой массы растений, в контрольных же растениях (без азотной подкормки) было 71 мг аминокислотного азота. Если судить только по этим данным, то можно прийти к выводу, что азотная подкормка за 24 часа не оказала существенного влияния на образование аминокислот в растении. Вопреки этому изотопный анализ показал, что выделенный из подкормленных растений азот аминокислот содержит значительный избыток атомов N*5. Экспериментально найденное обогащение этой фракции азота изотопом N15 было равным 1,95. Отсюда следует, что за истекшие 24 часа после внесения азотной подкормки аминокислотный состав растений обновился на 23,75% [28]. Это. значит, что по крайней мере 23,75% от общего количества свободных аминокислот в растении было вновь синтезировано за 24 часа опыта. И если химический анализ не смог этого обнаружить, то только потому, что в результате непрерывно происходящего в растении обмена веществ аминокислоты использовались на синтез белка, хлорофилла и общее содержание их в растении в течение опытного периода было близким к исходной величине.

Применение в качестве азотной подкормки сульфата аммония, меченного изотопом N15, в наших исследованиях (1) позволило установить, что в молодых растениях (рожь, щавель) непрерывно происходит весьма интенсивное обновление азотистого состава белка и хлорофилла.

Существовавшее ранее представление об относительной стабильности конституционных белков растений оказалось неправильным. Конституционные белки протоплазмы, так же как и запасные вегетативные белки, вовлекаются в общий обмен веществ в организме растений и непрерывно обновляются.

В настоящем сообщении излагаются результаты дальнейших исследований азотного обмена растений с применением меченых атомов азота.

Растения для этих исследований выращивались в торфопесчаных культурах в условиях вегетационного павильона. Питательная смесь, вносившаяся до посева растений, включила 0,3 г N на сосуд (6 кг песка) в форме обычного сульфата аммония и все остальные элементы в нормальных их дозах. В соответствующие стадии развития растениям давалась азотная подкормка в форме сульфата аммония, обогащенного изотопом N15. Продолжительность экспозиции растений на внесенной подкормке, меченной N15, варьировала в отдельных опытах от 6 до 120 часов. По истечении установленного срока экспозиции растения убирались, взвешивались и поступали на анализ. Одновременно в те же сроки производилась уборка растений из контрольных вариантов, гдр не применялась подкормка меченым азотом. Методика выделения из растений отдельных азотистых фракций ранее описана [1].

В первом опыте с овсом подкормка меченым азотом производилась через 24 дня после появления всходов сульфатом аммония с 3-кратным обогащением N15 в дозе 0,24 г N_ на сосуд..

В таблице 1 приводятся данные учета урожая зеленой массы растений и содержания в нем различных фракций азота по отдельным вариантам опыта.

Из этих данных следует, что по мере удлинения сроков после внесения азотной подкормки содержание почти всех фракций азота в растениях в общем повышается, хотя в отдельных случаях эта картина несколько нарушается. Последнее, ло-видимому, может быть объяснено динамичностью процессов азотного обмена в растениях — образованием одних форм азотистых соединений в растениях за счет распада других азотистых веществ.

В таблице 2 приводятся данные изотопного анализа различных фракций азота, выделенных из зеленой массы молодых растений овса в этом опыте.

Из данных таблицы 2 видно, что поступивший в растение минеральный азот (NH3) включается в состав отдельных органических азотистых соединений в известной последовательности. Вначале происходит синтез небелковых азотистых органических соединений (аминокислоты, амиды), образование же белков происходит несколько позже. При этом из двух групп белковых веществ конституционные белки синтезируются зна-

Урожай зеленой массы овса и содержание в нем отдельных фракций азота в различные сроки после внесения подкормки с меченым азотом

Таблица 2

Результаты изотопного анализа отдельных фракций азота, выделенных из массы молодых растений овса

• Содержание меченого азота выражено в пересчете на 3-кратное обогащение N15, т.
  е. за 100% принято обогащение изотопов N15, взятого для подкормки сульфата аммония.

чительно быстрее, чем запасные белки. Такое заключение полностью совпадает с результатами ранее проведенных нами исследований с молодыми растениями озимой ржи.

Полученные в этом опыте данные свидетельствуют и о трм что в растениях, помимо нового синтеза белков и хлорофилла,

m

происходит непрерывное обновление азотистого состава «старых» молекул белка и хлорофилла. Это прежде всего следует из того, что относительное содержание меченого азота в конституционных белках и хлорофилле значительно превышает те изменения, которые произошли в общем содержании азота этих фракций после внесения подкормки с меченым азотом.

Приведенные в таблице 2 данные о содержании меченого азота в белках и хлорофилле не выражают, однако,- действительной степени обновления этих фракций, которая в действительности намного выше.

При составлении этой таблицы для вычисления процентного содержания меченого азота в исследуемой фракции за 100%' принималась величина обогащения изотопом N15 сульфата аммония, применявшегося для подкормки, т. е. в данном случае 3-кратное обогащение N15. Такой способ определения степени обновления азота в исследуемых фракциях будет правильным только применительно к аминокислотам и амидам, на синтез которых непосредственно используется аммиачный азот сульфата аммония, внесенного в качестве подкормки. Но на построение белков и хлорофилла идет не аммиак как таковой, а продукты его превращения, и прежде всего аминокислоты.

При вычислении степени обновления азота этих соединений мы должны исходить не из степени обогащения изотопом N15 сульфата аммония, взятого для подкормки, а из степени обогащения изотопом N15 небелковых органических соединений азота, которые непосредственно используются для синтеза белка и хлорофилла.

При таком логически необходимом условии вычисление действительной степени обновления белков и хлорофилла на каждый данный момент все же представляет то затруднение, что мы не знаем, какова была степень обогащения N15 у непосредственных предшественников этих веществ в тот именно момент, когда они были вовлечены в синтез белка и хлорофилла.

На первых порах после внесения азотной подкормки, в результате интенсивно идущего синтеза аминокислот за счет непрерывно поступающего в растение меченого источника азота, происходит постоянное возрастание степени обогащения изотопом N15 небелковой фракции. В этом случае мы можем сказать, что степень обновления белков и хлорофилла, рассчитанная по данным изотопного анализа соответствующих фрак

ций азота, выделенных из растений в один и тот же срок, заведомо приуменьшена против действительной.

Однако в какой-то момент в результате непрерывно происходящих процессов обновления белка в небелковую фракцию азота наряду с меченым азотом, поступающим из почвы, попадает в большем или меньшем количестве и небелковый азот, образовавшийся в результате распада белковых молекул, синтезированных в более ранние сроки, еще без участия меченого азота. Следовательно, может оказаться, что в этот момент степень обогащения изотопом. N15 небелковой фракции будет ниже, чем она была за некоторое время до этого. В этом случае вычисление степени обновления белка по данным изотопного анализа одновременно выделенных небелковой и белковой фракций азота даст преувеличенные результаты, так как какая-то часть белковых молекул была синтезирована в тот момент, когда степень обогащения предшественника белка — небелковой фракции была выше, чем в момент взятия пробы.

Таким образом, вычисляя степень обновления белка и пир- рольного ядра хлорофилла путем отнесения найденных величин обогащения изотопом N15 этих фракций к степени обогащения одновременно выделенной фракции небелкового азота (приняв последнюю за 100), мы, по-видимому, .получим лишь первое приближение к истинным значениям искомых величин. Но когда степень обогащения изотопом N15 предшественников белка и хлорофилла практически станет равной степени обогащения изотопом N15 самого белка и хлорофилла, мы с полным основанием можем утверждать, что в этот момент произошло полное обновление азотного состава белка и хлорофилла.

В таблице 3 приведены вычисленные таким путем величины обновления азота белка и хлорофилла в растениях при различной продолжительности их экспозиции в меченом сульфате аммония.

Таблица 3

Степень обновления азота белков и хлорофилла в молодых растениях овса

Рис. 1. Изменение в содержании конституционных белков, азота хлорофилла и степень их обновления при различной продолжительности экспозиции растений на меченом азоте (в % от исходных величин).

Приведенные в таблице 3 данные позволяют сделать вывод о чрезвычайно высокой интенсивности процесса обновления азотистого состава белка и хлорофилла. Особенно интенсивно обновляются конституционные белки. Обновление азотистого состава белка и хлорофилла только в сравнительно небольшой степени обусловлено увеличением массы этих веществ за счет внесенного в подкормку азота. Так, например, через 48 часов после внесения подкормки с меченым азотом общее содержание в растениях азота конституционных белков и хлорофилла увеличилось против исходного положения соответственно на 18 и 14 %:. В этот же срок азотистый состав конституционных белков и хлорофилла обновился на 62,6 и 57,5%.

Еще больше разница между общим увеличением азота белков и хлорофилла в растении и степенью обновления азотистого состава этих веществ для более кратковременных сроков экспозиции растений на меченом азоте (рис. 1). Таким образом, установленное в этих опытах обновление азотистого состава белка и пиррольного ядра хлорофилла в основном обусловлено непрерывно происходящим в организме растений процессом распада и самообновления этих веществ. Этот процесс протекает в молодых растениях чрезвычайно интенсивно. В течение 72 часов произошло почти полное обновление конституционного белка (91%) и азота хлорофилла (95%). Обновление

запасных белков происходит медленно, но и эти белки через 120 часов практически полностью обновляются.

В другой серии опытов мы изучали интенсивность обновления белков и хлорофилла в растениях на более поздней стадии их развития. Такие опыты были проведены с овсом в стадии колошения и с тимофеевкой — перед началом колошения. В качестве азотной подкормки в этих опытах применялся сульфат аммония с 5-кратным обогащением изотопом N15 в дозе

0. 25 г N на сосуд.

Приведенные в таблице 4 данные показывают, что интенсивность обновления отдельных фракций белка и хлорофилла в значительной степени зависит от стадии развития растений. Если в ранних стадиях развития овса и- ржи (1) конституционные белки обновляются значительно быстрее и интенсивнее, чем запасные, то в стадии колошения запасные белки зеленой массы овса обновляются примерно с той же интенсивностью, как и конституционные белки, а в колосьях запасные белки обновляются даже значительно быстрее, чем конституционные. Такое же соотношение в интенсивности обновления конституционных и запасных белков имело место у тимофеевки в стадии, предшествующей колошению.

Повышение интенсивности обновления запасных белков в растениях во время колошения, возможно, находится в связи с процессами интенсивного оттока белковых веществ из вегетативных частей растений в репродуктивные органы, когда происходит усиленное образование запасных белков для формирования колоса. Интенсивность же обновления конституционных белков в стареющих органах растений падает. Особенно резко это проявилось в опыте с тимофеевкой, где конституционные белки даже за 120 часов обновились только на 66,7%, в то время как в молодых растениях овса и ржи конституционные белки полностью обновлялись в течение 72 часов. Интенсивность обновления хлорофилла при старении растений также падает. Если в молодых растениях овса и ржи (1) азот хлорофилла в течение 48 часов обновлялся примерно на 60%, то в стадии колошения овса за тот же период обновилось только 25% азота хлорофилла.

Таким образом, в качестве общего вывода следует признать, что интенсивность обновления белка и хлорофилла в растениях изменяется в зависимости от фаз развития растений. По мере старения растений интенсивность обновления конституционных белков и хлорофилла падает.

В итоге всех проведенных за последние два года исследований с применением меченого азота мы приходим к выводу, что в растениях непрерывно происходят процессы обновления азотистого состава белков и хлорофилла. В молодых растениях в нормальных условиях их питания азот конституционных белков и хлорофилла полностью обновляется в течение 72 часов.

Результаты опытов по изучению азотного обмена с применением изотопа N15

тимофеевка перед

В молодых растениях овса уже при 12-часовой их экспозиции обновлялось около 40%' азота конституционных белков и около 20% азота хлорофилла. В опытах с рожью значительное обновление азота белка было констатировано в еще более короткие сроки — между 2 и 4 часами.

Таким образом процессы обновления белка и азотистого компонента хлорофилла характеризуются весьма высокой скоростью. Мы еще не знаем механизма обновления белка и хлорофилла. По-видимому, при обновлении белка происходит только обмен отдельных составных частей молекулы белка, без ее полного распада, путем временного размыкания пептидных связей и включения аминокислоты между концами раскрытых цепей.

Процесс самообновления белка играет фундаментальную роль в органическом мире. Для поддержания прижизненного состояния биологических структур необходима постоянная затрата энергии. Источником энергии в белковых структурных элементах организмов может служить непрерывное окисление входящих в состав белка аминокислот. Взамен окислившихся аминокислот в белковую молекулу включаются новые аминокислоты, чем и обеспечивается сохранение постоянства состава белка. Освобождающиеся в процессе окисления аминокислот безазотистые остатки вовлекаются в общий обмен веществ в растении и, взаимодействуя с поступающим извне или образующимся в самом растении аммиаком (при дезаминировании аминокислот), могут давать новые аминокислоты.

Несмотря на интенсивное самообновление, соотношения отдельных аминокислот в белке являются довольно постоянными. Это в известной мере дает основание предполагать, что процессу обновления белка должно предшествовать образование всего набора аминокислот, составляющих белковую молекулу.

у растений в более поздние стадии их развития: овес в стадии колошенияг колошением

В этой связи представлялось важным определить скорость образования отдельных аминокислот в растении за счет использования ими внесенного в подкормку азота.

Исследования при помощи хроматографического метода,, проведенные в нашей лаборатории в течение 1952 и 1953 гг., показали, что синтез отдельных аминокислот за счет поступившего в растение аммиака осуществляется в определенной последовательности: первым синтезируется аланин, затем дикар- боновые аминокислоты — аспарагиновая и глутаминовая кислоты.

Синтез основных и ароматических аминокислот происходит в более поздние сроки.

В таблице 5 приведены данные опыта, из которых следует, что аммиачный азот, поступая в корни растений, в первую очередь здесь же и перерабатывается на аминокислоты. Уже через полчаса после внесения азотной подкормки в корнях овса накапливается аланин, количество которого по мере удлинения срока экспозиции вначале резко возрастает, а затем падает. Образование глутаминовой кислоты в корнях отмечено в более поздние сроки — через 4 часа, образование аспарагина через 20 часов. Еще позже образуется серин — через 44 часа, а образование триптофана и гистидина в корнях в пределах 44-часового срока не было обнаружено.

Синтез аланина и дикарбоновых аминокислот в растениях, по-видимому, осуществляется непосредственно путем восстановительного аминирования amp;-кетокислот при взаимодействии их с аммиаком. Тот факт, что первой аминокислотой, синтезируемой в растениях в результате переработки аммиака, является аланин, по-видимому, обусловлен тем, что в растениях в качестве постоянного метаболита в процессе дыхания всегда образуется пировиноградная кислота, которая очень легко при

Результаты исследования молодых растений овса на содержание в них отдельных аминокислот в различные сроки после внесения подкормки в виде сульфата аммония (в мг N на 100 г сырой массы)

взаимодействии с аммиаком дает аланин. Образование аланина при введении в растение аммиака происходит почти мгновенно. В проведенных в нашей лаборатории опытах В. С. Хохряковой с вакуумной инфильтрацией в растения растворов аммиака образование аланина можно было обнаружить уже через 5 минут после инфильтрации аммиака.

По мере израсходования в корнях запасов а-кетокислот, необходимых для синтеза аминокислот, поступающий из почвы аммиак не может уже полностью связываться в корнях и направляется в надземные органы растений. В этом опыте образование аланина в листьях овса за счет переработки внесенного в подкормку аммиачного азота было обнаружено через 2 часа, образование дикарбоновых аминокислот в зеленой массе растений, так же как и в корнях, происходило позже, а синтез триптофана и гистидина — в самые поздние сроки — через 44 часа после внесения в подкормку сульфата аммония.

Имеются основания считать, что ароматические и основные аминокислоты образуются в растениях не путем прямого взаимодействия между аммиаком и соответствующими органическими кислотами, а в результате реакций переаминирования. Именно такое заключение вытекает из проведенных в нашей лаборатории исследований над образованием в растениях отдельных аминокислот при кратковременной их экспозиции на растворах аммиака и последующем выключении аммиака из питательного раствора. В этих опытах образование триптофана и гистидина в растениях было констатировано только через 30— 40 часов после того, как весь поглощенный растениями аммиак был переработан в растении на синтез аланина и дикарбоновых

аминокислот. При некотором избытке поступающего в растение аммиака происходит образование аспарагина в результате амидирования аспарагиновой кислоты.

Таким образом, из всего этого следует, что если аланин и дикарбоновые аминокислоты сразу же синтезируются после поступления в растения аммиака, то другие аминокислоты, в частности основные и ароматические аминокислоты, синтезируются только через значительный промежуток времени — через 30—40 часов. Но мы видели, что процесс обновления белков в растениях осуществляется с весьма большой скоростью. Уже через 12 часов после внесения в подкормку меченого азота происходило значительное обновление азотистого состава белков. Но к этому времени такие необходимые для синтеза белков аминокислоты, как триптофан и гистидин, не могли еще образоваться в растениях за счет внесенного в подкормку меченого азота. В этОг срок могли образоваться только аланин и дикарбоновые аминокислоты. Отсюда вытекает предположение, что значительная часть из всего набора аминокислот, входящих в состав белка, и прежде всего ароматические и основные аминокислоты, образуются путем реакций переаминиро- вания за счет аминогрупп аланина и дикарбоновых кислот не- посредственно, в процессе обновления белковой молекулы.

В процессе обновления белка общее количество его в растении в известных границах может оставаться более или менее постоянным. Если, например, исключить из питательной среды азот, то абсолютное содержание белка в растении, несмотря на непрерывное его самообновление, в течение известного времени будет близким к одной и той же величине. При снабжении растений азотом одновременно с обновлением ранее синтезированных молекул белка будет происходить и синтез новых его молекул, в результате которого общее содержание белка в растении возрастает. Синтез новых молекул белка происходит с меньшей скоростью, чем обновление «старых» молекул. При внесении азотной подкормки в растении через сравнительно короткие промежутки времени может быть констатировано значительное возрастание содержания аминокислот при почти неизменившемся содержании белка. Вместе с тем применение меченого азота позволяет установить, что за этот же срок произошло значительное обновление и азотистого 'состава белков. Но изменения в общем содержании белка в растении могут быть обнаружены только через более длительные промежутки времени.

Проведенные нами исследования показали, что новый синтез белка сопровождается одновременной убылью сахаров в растений [1].

Последнее дает основания считать, что сахара играют большую роль в процессе синтеза белка в растениях. Можно сделать допущение, что нативный белок в растениях находится в

NH3

Рис. 2. Схема превращения аммиака в растении.

какой-то связи с сахарами. С другой стороны, можно предположить, что процесс синтеза белка в растениях сопровождается интенсивным окислением сахаров, в результате чего освобождается энергия, необходимая для активации молекул аминокислот, вовлекающихся в реакции синтеза белка.

Результаты проведенных нами исследований азотного обмена растений могут быть представлены в виде схемы (рис. 2).

В этой схеме вертикальными стрелками указаны основные пути превращения в растениях азота, начиная от поступления неорганического азота до синтеза новых молекул белка в растении. Горизонтальными стрелками показано, на каких этапах происходит наиболее интенсивное вовлечение в азотный обмен соответствующих безазотистых органических веществ растений. На правой стороне указано время, в течение которого могут быть обнаружены количественные изменения в соответствующих звеньях азотного обмена, при внесении азотной подкормки, что может служить известным показателем скорости протекания исследуемых процессов.

Эта схема является, конечно, далеко не полной. Она отражает лишь главные направления и скорости отдельных звеньев азотного обмена и только в той мере, насколько это позволяли полученные в наших исследованиях экспериментальные данные.

1. Полученные экспериментальные данные по изучению изотопного состава отдельных фракций азота, выделенных из растений при различных сроках их экспозиции на сульфате аммония, обогащенном изотопом N15, показали, что в растениях происходит непрерывное обновление белка и пиррольного ядра хлорофилла. В молодых растениях азотистый состав конституционных белков и хлорофилла полностью обновляется в течение 72 часов.

Интенсивность обновления белка и хлорофилла зависит от фазы развития растений. Наиболее интенсивно этот процесс идет в молодых, быстрорастущих растениях. По мере старения интенсивность обновления белка и хлорофилла падает.

Процесс обновления «старых» молекул белка происходит с большей скоростью, чем процесс синтеза новых молекул белка.

2. Использование методов хроматографии в исследованиях первых продуктов усвоения растениями минерального азота позволило установить, что аминокислоты являются первыми устойчивыми соединениями при превращении аммиака в растениях. В корнях растений уже через 30 минут после внесения азотной подкормки происходит значительное возрастание содержания аминокислот. Синтез отдельных аминокислот за счет поступившего в растения аммиака осуществляется в определенной последовательности: первым синтезируется аланин, затем дикарбоновые аминокислоты. Синтез основных и ароматических аминокислот происходит значительно позже, по-види- мому, в результате процессов переаминирования. При избытке аммиачного азота в растениях происходит интенсивный синтез аспарагина.

ЛИТЕРАТУРА

1. Тур чин Ф. В., Гуминская М. А., Плышевская Е. Г. Изв. АН СССР. Серия биологическая, № 6, 1953.