<<
>>

Агробактериальная трансформация


Agrobacterium tumefaciens является широко распространенной естественной почвенной бактерией, которая вызывает образование корончатых галлов у растений и способна трансформировать клетки растений при помощи Ti-плазмиды [Чумаков, 2001].
Эта естественная способность была названа агробактериальной трансформацией растений. В настоящее время агробактериальная трансформация является наиболее часто используемым методом генной инженерии растений из-за достаточно высокой эффективности.
Первоначально считалось, что A. tumefaciens заражает только двудольные растения, но позднее было установлено, что также могут быть трансформируемы однодольные растения.
С открытием бактериального происхождения опухолевых заболеваний растений [Smith, Townsend, 1907], большое количество исследований были направлены на изучение механизма этого процесса, в первую очередь с надеждой понять механизмы онкогенеза в целом, и применимости его к изучению онкологических заболеваний у животных и человека.
В 1969 г. было показано, что вирулентные свойства агробактерий могут быть перенесены от одного вида агробактерий к другому [Kerr, 1969], что было подтверждено в 1975 г. [Johansen, Boye, 1975]. В 1971 г. в работе [Hamilton, Fall, 1971] было определено, что некоторые штаммы A. tumefaciens утрачивали способность к образованию опухолей на растениях при температуре 36° С. В 1977 г. было представлено доказательство того, что корончатый галл возникает после встраивания фрагмента Ti-плазмиды агробактерий в растительный геном [Chilton et al., 1977]. Данный фрагмент Ti-плазмиды, получил название Т-ДНК (рис.1.1).


Рисунок 1.1 Процесс агробактериальной трансформации растительных клеток [по Цитовски с соавт., 2007].


Т-ДНК содержит два вида генов:              онкогенные гены, кодирующие
ферменты, участвующие в синтезе ауксинов и цитокининов, ответственных за формирование опухолей; гены, ответственные за синтез опинов, которые производятся и экскретируются клетками корончатого гала, а затем потребляются A. tumefaciens в качестве источников углерода и азота. Вне Т- ДНК, на Ti-плазмиде расположены гены, ответственные за катаболизм опинов, а также гены, участвующие в переносе T-ДНК от бактерии к клеткам растений [Hooykaas, Schilperoort, 1992; Zupan, Zambrysky, 1995].
Результаты исследований процесса переноса T-ДНК в клетки растений продемонстрировали три важных факта для практического использования этого процесса для трансформации растений. Во-первых, формирование опухоли - это процесс трансформации растительных клеток в результате передачи и интеграции Т-ДНК и последующей экспрессии генов Т-ДНК. Во- вторых, гены Т-ДНК транскрибируются только в клетках растений и не
участвуют в процессе переноса. В-третьих, любая чужеродная ДНК, помещенная между границами Т-ДНК, может быть передана в клетку растения [Hooykaas, Schilperoort, 1992; Deblaere et al., 1985; Hamilton, 1997; Torisky et al., 1998].
В биоинженерии используется перенос чужеродных генов с помощью Т- ДНК для придания дополнительных свойств растениям (увеличение урожайности и устойчивость к патогенам и гербицидам).
К настоящему времени с помощью генетической трансформации, осуществляемой A.tumefaciens, получены трансгенные формы многих сельскохозяйственных видов растений [Чумаков, 2001].
Перенос чужеродных генов в растения посредством агробактериальной трансформации условно разделяется на несколько этапов: прикрепление Agrobacterium к клеточной стенке или мембране растительной клетки, экспрессия белков вирулентности, вырезание Т-нити, транспортировка Т- нити через мембраны бактериальной и растительной клеток и через ядерную пору, встраивание в ДНК растения. Процесс агробактериальной трансформации растительных клеток схематично представлен на рисунке 1.1 [Citovsky et al., 2007].
Одним из первых этапов является процессинг Т-нити. Белок VirD1 раскручивает ДНК в области правой границы Т-ДНК (рис.1.1). Далее, действуя как сайт-специфическая эндонуклеаза, VirD2 белок присоединяется к раскрученной Т-ДНК и делает разрыв между третьим и четвертым нуклеотидом в области правой границы Т-ДНК. Репликация региона Т-ДНК Тьплазмиды происходит до левой границы Т-ДНК. Процессинг Т-нити происходит путем ее вытеснения. Наряду с возможностью присоединяться к 5'-концу Т-ДНК, белок VirD2 имеет еще несколько уникальных особенностей (рис. 1.1). Он имеет две сигнальные последовательности, обеспечивающие прохождение через пору в ядерной мембране. N-конец этого белка отвечает за распознавание границ последовательности Т-ДНК, целостность цепи ДНК и присоединение VirD2 к Т-ДНК. На С-конце располагаются сигнальные последовательности, которые способствуют переносу Т-ДНК в ядро клетки растения (рис. 1.1).
Как процессинг, так и перенос Т-ДНК регулируется генами, расположенными в области вирулентности (vir-области) Ti-плазмиды A. tumefaciens. Вирулентная область включает восемь оперонов (virA, virB, virC, virD, virE, virF, virG, virH), кодирующих белки участвующих в обработке и транспортировке Т-ДНК в бактериальные и растительные клетки [Gelvin, 2003; Пирузян, 1985; Пирузян, 1988].
Размер Т-ДНК, переносимой в растительную клетку, составляет 12-22 тысяч п.н., ограниченную прямыми повторами по 25 п.н. - LB (left border) и RB (right border) (рис. 1.1) [Регана, Яеат, 1985; Vеluthаmbi et al., 1988; Wаng et al., 1984]. Т-ДНК включает 6-13 открытых рамок считывания и гены, ответственные за синтез опинов и ферментов синтеза ауксина и цитокинина.
Важную роль на стадии распознавания правой границы играют белки VirC1 и VirC2, хотя их функции полностью не раскрыты. Эти белки способны находить различия между правой и левой границами Т-ДНК и точно определять правую границу в качестве точки инициации репликации T-нити [Toro et al., 1988, 1989].
Совместно с белком VirD4, 11 белков VirB составляют систему секреции IV типа необходимую для переноса Т-ДНК и ряда других Vir белков, в том числе VirE2 и VirF [Christie, 1997; Pansegrau et al., 1993]. Белок VirD4 может служить в качестве "линкера", содействующего взаимодействию T-ДНК- VirD2 комплекс с VirB-аппаратом секреции.
Большинство белков VirB либо образовывают мембранные каналы, либо служат АТФ-азами для получения энергии для сборки каналов или процессов переноса. Некоторые белки, в том числе VirB2, VirB5, и, возможно, VirB7, составляют Т-пили [Jones et al., 1996; Lai, Kado, 1998, 2000; Eisenbrandt et al., 1999; Курбанова, Чумаков, 2000]. Роль Т-пилей в процессе транспорта Т-
ДНК и инфицирования растения остается не совсем ясной [Fullner et al., 1996; Fullner, Nester, 1996; Lai, Kado, 1998]. Вероятно, Т-пили участвуют в транспорте Т-ДНК из бактериальной клетки [Lai, Kado, 1998]. В работе [Durrenberger et al., 1991] было предположено, что Т-пили способствуют лучшему контакту бактериальной и растительной клеток. Однако, в работе [Калаптур c соавт., 2004] данное предположение не подтвердилось.
В работе [Chandran et al., 2009] рассматриваются три агробактериальных белка VirB7, VirB9 и VirB10, собирающиеся в пору, охватывающую внутреннюю и внешнюю мембраны грамотрицательных бактерий. Эта пора состоит из 14 копий каждого из трех белков (VirB7, VirB9 и VirB10) и образует два слоя. На рисунке 1.2 представлена кристаллическая структура мембранного комплекса, являющегося крупнейшим внешним мембранным каналом, который не имеет аналогов у бактерий в настоящее время. Интересно отметить, что белок VirB10, обладает двумя трансмембранными областями, пересекающими мембрану агробактерий. Сравнение криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) и кристаллографических структур указывает на конформационных изменения, регулирующие открытие канала и закрытие.

Рисунок 1.2 Белковый поровый комплекс IV типа секреции агробактерий (вид сбоку) [из Chandran et al., 2009].


В последующей работе группы Кристи с соавторами [Banta et al., 2011] рассматривалась модель, где белок VirB10 регулирует проход субстрата путем скрининга мутаций. Они вызывают нерегулируемый выпуск белка VirE2 к поверхности клетки независимо от контакта с клеткой-мишенью. Чтобы проверить эту модель, были исследованы мутации белка VirB10, которые нарушают воротный механизм в канале системы секреции IV типа. Были обнаружены мутации, которые обуславливали нерегулируемый выпуск белка VirE2 к поверхности клетки, а также увеличенное поглощение детергентов и большого количества антибиотиков. Эта мутация Gly272R (рис. 1.3) находится недалеко от AP (antenna projection) поры и делает белок VirB10 конформационно нечувствительным к клеточным АТФ, блокируя пору в открытой конформации.

Рисунок 1.3 Белковый поровый комплекс IV типа секреции агробактерий [из Banta et al., 2011]. А - Ленточная модель белка VirB10 серым отмечена в-бочка, зеленым - домен antenna projection (AP); Б - Поровый комплекс, состоящий из белков VirB7, VirB9, VirB10 (вид в разрезе).


В данной работе рассматриваются два возможных пути попадания Т-ДНК в клетку через плазматическую мембрану. Первым является формирование поры из агробактериального белка VirE2, через которую Т-ДНК переносится в клетку [Dumas et al., 2001; Чумаков с соавт., 2010]. Другим возможным путем проникновения Т-ДНК в растительную клетку может быть эндоцитоз [Чумаков, 2001]. 
<< | >>
Источник: ГУСЕВ Юрий Сергеевич. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ БЕЛКА VirE2 В ПЕРЕНОСЕ оцДНК ВЭУКАРИОТИЧЕССКИЕ КЛЕТКИ. 2014

Еще по теме Агробактериальная трансформация:

  1. Глава 5. ТРАНСФОРМАЦИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ ОСТАТКОВ И ОРГАНИЧЕСКИХ УДОБРЕНИЙ В ПОЧВЕ
  2. Общие факторы трансформации почв
  3. Трансформация дерново-подзолистых почв
  4. ТРАНСФОРМАЦИЯ ВОДНЫХ МАСС И ПСЕВДОПОПУЛЯЦИИ
  5. Трансформация почв в скважинных зонахгазоносных территорий
  6. ТРАНСФОРМАЦИЯ ТРАВЯНОГО ЯРУСА ГИДРОМОРФНЫХСООБЩЕСТВ В СВЯЗИ С ОСУШЕНИЕМ И СЕЗОННЫМИКОЛЕБАНИЯМИ ПОГОДЫ
  7. Трансформация выщелоченных черноземов
  8. ТРАНСФОРМАЦИЯ ВОДНЫХ МАСС И МОРФО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ АДАПТАЦИЯ ПЛАНКТОННЫХ ПОПУЛЯЦИИ
  9. Трансформация почв под воздействием нефти и нефтепродуктов
  10. Трансформация почв под воздействием солей буровых растворов и пластовых вод
  11. МИКРОБНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ МЕТАНА, ДИОКСИДА УГЛЕРОДАИ ЗАКИСИ АЗОТА В ОКУЛЬТУРЕННЫХ ТОРФЯНЫХ ПОЧВАХ В. В. Новиков, А. Л. Степанов, А. И. Поздняков
  12. Пространственно-временные закономерности развития болотных систем в голоцене
  13. ДЕСТРУКЦИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО ВЕЩЕСТВАВ ТОРФЯНОЙ ЗАЛЕЖИ КИРСАНОВСКОГО БОЛОТА Е. А. Головацкая, Л. Г. Абзалимова, Е. В. Порохина
  14. ПРИБЛИЖЕННАЯ ОЦЕНКА САМООЧШЦАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИБОЛОТ В ОТНОШЕНИИ СТОЧНЫХ ВОД