<<
>>

ОЦЕНКА СОСТАВА МЕТАНОГЕННЫХ АРХЕЙ В ТОРФЯНЫХ ПОЧВАХС ПОМОЩЬЮ ПЦР-ДГГЭ ТЕХНОЛОГИИ А.              К. Кизилова, М. В. Чистотин, И. К. Кравченко

  'Учреждение Российской академии наук Институт микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН, Москва
alegrria@gmail.com
** Учреждение Российской академии наук Институт лесоведения РАН,
Успенское, Одинцовский район, Московская обл.

С помощью ПЦР-ДГГЭ методов, основанных на анализе 16S рРНК, проведено исследование разнообразия архей в торфяных почвах осушенных торфяников и естественных болот Дубненского болотного массива (Талдомский район, Московская обл.). Установлено, что в составе метаногенных сообществ преобладают организмы, наиболее близкие к представителям порядка Methanosarcinales. Наряду с метаногенами в торфяных почвах обнаружено значительное количество некультивируемых представителей Crearchaeota.
Введение
Торфяные почвы, широко распространённые в России, являются одним из основных естественных источников поступления метана в атмосферу нашей планеты. Вклад метана в парниковый эффект составляет 30 % от вклада диоксида углерода, при этом метан примерно в 20 раз более активен [1]. В болотах законсервировано большое количество органического вещества, которое при вмешательстве человека и осушении болот для их последующего сельскохозяйственного использования, разлагается с выделением диоксида углерода и метана [2]. Наиболее заметные антропогенные изменения потоков метана из торфяных почв связаны с осушением и освоением болот для добычи торфа и сельскохозяйственного использования. В России насчитывается более 5 млн. га мелиорированных для сельского хозяйства избыточно увлажненных земель, большей частью представленных торфяными почвами [3], однако сведения о закономерностях газообмена метана в этих почвах крайне ограничены, а данные о составе и разнообразии микроорганизмов, ответственных за образование и поступление метана в атмосферу отсутствуют. Цель настоящего исследования состояла в изучении метаногенных сообществ естественных, осушенных и искусственно залуженных торфяников с помощью методов молекулярной экологии.
Материалы и методы
Исследования проводили с образцами торфяных почв осушенной части Дубненского болотного массива в Талдомском районе Московской области (56°42' с.ш., 37°50' в.д.), который был частично осушен в 1979 году для добычи торфа и сельскохозяйственного использования. В настоящее время добыча торфа ведется лишь на нескольких участках, большинство торфоразработок были залужены и сейчас частично используются для сенокошения и выращивания овощных культур. Почва была отобрана в октябре 2009 г. с тех участков, на которых проводятся регулярные полевые измерения эмиссии углеродсодержащих парниковых газов [4] и в вегетационном опыте, моделирующем стадии создания сенокоса на осушенной торфяной почве (табл. 1).
Выделение ДНК. Выделение тотальной ДНК из торфяных почв проводилось с помощью готового набора реактивов PowerSoil DNA Kit, MO BIO, США, согласно рекомендациям производителя.
Полимеразная цепная реакция. Использовали систему праймеров 344F-915R [5], которая позволяет амплифицировать фрагмент гена 16s РНК архей длиной около 570 пар нуклеотидов. Смесь для проведения реакции состояла из буфера (2,5 mM MgCl2) и полимеразы (1,25 U) производства компании Хеликон, праймеров (0,5 mM/ml каждого праймера), смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов (0,2 mM/ml каждого NTP), бычьего сывороточного альбумина (0,2 mM/ml).
Амплификация проводилась на термоциклере MyCycler (BioRad) со следующим температурным профилем: начальная денатурация 94 °С - 5 минут, затем 20 циклов, состоящих из денатурации 94 °С - 1 минута, отжига праймеров 71 °С с последующим понижением температуры на полградуса каждый цикл - 1 минута, и удлинения цепи 72 °С - 3 минуты. Заключительная стадия ПЦР состояла из 15 циклов денатурации 94 °С - 1 минута, отжига праймеров 61 °С - 1 минута, и элонгации фрагмента ДНК - 3 минуты. Финальная элонгация шла 5 минут при 72 °С.
Таблица 1
Объекты наблюдений

Участок

Точки наблюдений

Добыча торфа
основная поверхность дно канала
повышение

Сенокос
основная поверхность дно канала

Естественное болото

7 основная поверхность повышение

Вегетационный опыт

0,0 нарушенное сложение 2,0 естественное сложение

Денатурирующий градиентный гель-электрофорез и секвенирование. Разделение полученных ампликонов проводили с помощью системы для DGGE фирмы BioRad, США в 0.5 TAE буфере, нагретом до 60 °С, в течение 6 часов при 200V. Полиакриламидный гель (8 % акриламида) содержал градиент денатурантов (формамид и мочевина) от 40 до 60 %. Окрашивание проводили бромистым этидием, после чего гель отмывали дистиллированной водой и фотографировали в УФ (GelDoc, BioRad, США). Характерные полосы вырезали стерильным скальпелем и элюировали ДНК в стерильной деионизованной воде в течение 24 часов. Элюат использовали как матрицу для постановки реамплификации. Полученный ПЦР-продукт очищали с помощью фермента и секвенировали в сервисной лаборатории с помощью набора реактивов Big Dye Terminator v.3 sequencing kit (Applied Biosystems Inc., United States). Полученные последовательности были проанализированы с помощью программного пакета BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, http://blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Результаты и обсуждение
Проведенные исследования in situ установили, что осушенные и используемые под сенокос торфяные почвы выделяют значительное количество метана в атмосферу (рис. 1)
Применение вышеописанной системы праймеров позволило выявить архей во всех почвах, кроме неосушенного болота (образец 7). Отсутствие сигнала, возможно, объясняется повышением в месте отбора образца, где, по всей вероятности, не соблюдались условия, необходимые для развития данных организмов. Для остальных 6 образцов были успешно получены и разогнаны на полиакриамидном геле ПЦР-продукты (рис. 2). Для дальнейшего анализа была вырезана и реаплифицирована 21 полоса. Обнаруженные археи не ограничивались метаногенами - во многих образцах были детектированы представители Crenarchaeota (табл. 2).


В образцах торфоразработок были, в основном, выявлены некультивируемые представители кренархей и несколько эвриархей, которые пока не были идентифицированы. Что касается торфяников, подвергавшихся сельскохозяйственной обработке, архей в них оказалось довольно много, и все они проявили высокое сходство (95-96 %) с метаногенами рода Methanosarcina и других представителей порядка Methanosarcinales. В почвах вегетационного опыта было отмечено присутствие и кренархей - 97-98 % сходства с депонированными в GenBank последовательностями некультивируемых организмов, и эвриархей, демонстрирующих близкое родство как с Methanosarcina sp. (96 %) так и с некультивируемыми метаногенными организмами (97-98 %). Полученные данные о составе метаногенных сообществ хорошо согласуются с данными по потокам метана (рис. 1). В течение всего периода наблюдений торфоразработки демонстрируют почти полное отсутствие эмиссии и молекулярный анализ не обнаружил в них представителей метаногенный архей. Залуженные почвы, на которые велась заготовка сена, напротив, выделяют

большее количество метана по сравнению с остальными образцами, что подтверждается наличием в них метаногенных архей рода Methanosarcina и порядка Methanosarcinales. Неосушенное болото, в котором археи не были обнаружены, также характеризуется почти нулевой эмиссией метана. В вегетационном опыте археи представлены некультивируемыми формами кренархей и эвриархей, часть из которых показало высокое сходство с Methanosarcina sp. (96 %). Интересно отметить присутствие в образцах представителей Methanobacteriales, которые не были выявлены в образцах почв торфяников.
Таблица 2
Разнообразие архей в торфяных почвах Талдомского района

Образец

Номер
полосы

Ближайший организм, фрагмент 16S RNA

Покрытие/
сходство

Т2


Uncultured crenarchaeote clone Pav-sed-511 (GU135491)

100 / 99


Uncultured Thermoproteales archaeon (AM501891)

99 / 92


2

Uncultured euryarchaeote (AB119617)

99 / 86


3

Uncultured archaeon (AM712497)

100 / 96

Т3

Uncultured euryarchaeote clone Sai_E1_37 (GU257007)

100 / 94

4

Uncultured Thermoproteales archaeon (AM501889)

100 / 94


5

Uncultured marine group I crenarchaeote clone HF770_041I11 (DQ300544)

98 / 84


6

Uncultured crenarchaeote (AM291985)

100 / 93

Т5

7

Methanosarcina sp. (L48408)

99 / 92

8

Uncultured Methanosarcinales archaeon (AB448783)

100 / 96


9

Uncultured methanogenic archaeon clone PASLSS0.5m_1 (FJ982666)

100 / 96


Uncultured Methanosarcinales archaeon (AB448783)

100 / 94

Т6

10

Uncultured Methanosarcinales archaeon (AB448783)

98 / 88

11

Uncultured Methanosarcinales archaeon (AB448783)

97 / 95


12

Uncultured Methanomicrobia archaeon clone LPBBA93 (FJ902710)

100 / 91


13

Uncultured archaeon clone ZA_P5_C01 (GQ328162)

93 / 89


14

Uncultured crenarchaeote clone RotF-135iia (DQ278152)

100 / 97


15

Uncultured Euryarchaeote (AJ867613)

100 / 98

Т0.0

16

Uncultured crenarchaeote clone CSI.5_4.5_2 (GQ141963)

100 / 97

17

Uncultured crenarchaeote clone RotF-135iia (DQ278152)

100 / 98


Crenarchaeote (AJ006919)

100 / 97


18

Methanosarcina sp. (L48408)

100 / 96


19

Methanosarcina sp. HC-2 (AB288264)

100 / 96

Т2.0

20

Uncultured crenarchaeote clone Beu4A-40 (AY625575)

95 / 92

21

Uncultured euryarchaeote isolate SSCP band Bo64-10-16 (DQ004712)

97 / 80


Uncultured Methanobacteriales archaeon CSIRO1.33 (AY351466)

78 / 80

Выводы Изучение состава метаногенных сообществ различных торфяных почв методом ПЦР-ДГГЭ показало, что среди метанобразующих архебактерий представители рода Methanosarcina и порядка Methanosarcinales. Система олигонуклеотидных праймеров, использованная в работе, охватывает всё разнообразие архей в изучаемых образцах, а не только метаногенов. Обнаружено присутствие в этих почвах большое количество некультивируемых кренархей. Полученные результаты находятся в соответствии с данными по эмиссии метана из исследованных торфяных почв.
Литература Бажин Н. М. Метан в атмосфере // Соросовский образовательный журнал. Химия. - 2000. Т.6.- № 3. - С. 52-57. Oleszczuk R., Regina K., Szajdak L., ^per H., Maryganova V. Impacts of agricultural utilization of peat soils on the greenhouse gas balance. In: Edited by Maria Strack. Peatlands and climate change. 2008.- Jyvaskyla: International Peat Society. - P. 70-97. Торфяные болота России: к анализу отраслевой информации / Под ред. А. А. Сирина, Т. Ю. Минаевой. - М.: Геос, 2001. - 190 с. Чистотин М. В., Сирин А. А., Дулов Л. Е. Сезонная динамика эмиссии углекислого газа и метана при осушении болота в Московской области для добычи торфа и сельскохозяйственного использования // Агрохимия. - 2006. - №6.- С. 54-62. Casamayor E. O., Schafer H., Baneras L., Pedros-Alio C., Muyzer G. Identification of and spatio- temporal differences between microbial assemblages from two-neighboring sulfurous lakes: comparison by microscopy and denaturing gradient gel electrophoresis // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - № 66. - P. 499-508.
STUDYING METHANOGENIC COMMUNITIES
OF PEAT SOILS BY MEANS OF PCR-DGGE TECHNIQUE K. Kizilova, M. V. Chistotin, I. K. Krachenko
PCR-DGGE technologies, based upon 16S RNA, were used for assessing diversity of methanogenic archaea in peat soils of drained peat bogs and natural bogs of Dubna bog territory (Taldom district, Moscow region). Our research showed that most abundant archae were most closely related to Methanosarcinales. Moreover, along with methane- producing microorganisms, lots of non-methanogenic uncultured Crenarchaea were detected.

УДК 633.2:504.03
<< | >>
Источник: Л. И. Инишева. Болота и биосфера : материалы VII Всероссийской с международным участием научной школы. 2010

Еще по теме ОЦЕНКА СОСТАВА МЕТАНОГЕННЫХ АРХЕЙ В ТОРФЯНЫХ ПОЧВАХС ПОМОЩЬЮ ПЦР-ДГГЭ ТЕХНОЛОГИИ А.              К. Кизилова, М. В. Чистотин, И. К. Кравченко:

  1. АНАЛИЗ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ ОСУШЕННЫХ ТОРФЯНЫХ ПОЧВ МЕТОДОМ FISH Е. В. Менько, И. К. Кравченко
  2. Влияние литологического состава подстилающих пород на генезис торфяных отложений
  3. Оценка дифференцирующей способности среды опытов (технологий возделывания) Анализ по С.П. Мартынову
  4. ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО ПОКРОВА ПОСЛЕСИЛЬНОГО ТОРФЯНОГО ПОЖАРА
  5. Р.В. Кравченко. Агробиологическое обоснование получения стабильных урожаев зерна кукурузы в условиях степной зоны Центрального Предкавказья : монография. - Ставрополь. - 208 с., 2010
  6. Изменение состава органического вещества под влиянием окультуривания почв
  7.   ОРГАНОЛЕПТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА КОРМОВ 7.1.1. ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ЗЕЛЕНЫХ КОРМОВ  
  8. Урожайность зерна гибридов кукурузы в зависимости от интенсивности технологии возделывания
  9. ИЗУЧЕНИЕ ВИДОВОГО СОСТАВА
  10. ИНДУСТРИАЛЬНАЯ ТЕХНОЛОГИЯ — ОСНОВА ВЫСОКИХ УСТОЙЧИВЫХ УРОЖАЕВ
  11. Биоэнергетическая эффективность возделывания гибридов и популяции кукурузы по технологиям различной интенсивност
  12. Одиннадцатая динамика. Технология игры
  13. ОСОБЕННОСТИ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА ПРИРОДНЫХ ВОДЛЕСОБОЛОТНЫХ КОМПЛЕКСОВ СИБИРСКИХ УВАЛОВ,ЗАПАДНАЯ СИБИРЬ
  14. Изменение состава растительных остатков в процессе их разложения
  15. ТОРФЯНЫЕ РЕСУРСЫ И ИХ ХАРАКТЕРИСТИКА