Задать вопрос юристу

  Количественное определение афлатоксинов В( и G( в кормах. Метод разработан Н. А. Соболевой.  

  В настоящее время известно четыре основных представителя семейства афлатоксинов (афлатоксины В|, В2, Gj и G2), однако наибольшее санитарно-токсикологическое значение представляет афлатоксин Bj. Продуценты афлатоксинов грибы Asperqillus flavus, A.
parasiticus. Гриб A. flavus широко распространен в России, однако оптимальная температура для образования афлатоксинов 25—30 °С, поэтому это микотоксины тропических стран — Индии, Тайланда, Бразилии и других с оптимальными условиями для их образования (высокая влажность и температура). В наибольшем количестве афлатоксины образуются в арахисовых орехах, зерне кукурузы и некоторых других культурах. Значительная часть арахисового шрота, произведенного во влажных зонах тропических стран, контамини- рована афлатоксином
Афлатоксин Bi относится к классу высокотоксичных соединений с ЛД50 для лабораторных животных 3—5 мг/кг. Особенно чувствительны к нему утки, индейки, форель, кролики. Афлатоксины обладают выраженным гепатотоксическим действием.
Принцип. Метод основан на экстракции токсинов из кормов водным ацетоном, очистке экстрактов от сопутствующих примесей гексаном, переэкстракции токсинов в хлороформ или бензол, их очистке на хроматографической колонке с силикагелем и алюминия оксидом и последующем определении с помощью тонкослойной хроматографии по флуоресценции в УФ-лучах.
Реактивы: ацетон (ч. д. а.); гексан (х. ч.); хлороформ для наркоза; толуол (ч. д. а.); кислота муравьиная (ч. д. а.); этилацетат (х. ч.);
натрия хлорид 4 %-ный водный раствор; метанол (х. ч.);
четыреххлористый углерод (х. ч.);

кислота уксусная (х. ч.); силикагель КСК; алюминия оксид; натрия сульфат безводный;
стандарт афлатоксина В[ производства ВНИИВСГЭ. Оборудование: готовые к употреблению пластинки для ТСХ типа «Силуфол», камера для хроматографирования; УФ-лам- па с длиной волны 365 нм; весы аналитические АДВ-200; микрошприц на 10 мкл; весы технохимические с точностью до 0,01 г; хроматографическая колонка диаметром 1,6 см, длиной 25 см; шуттель-аппарат; колбы мерные на 25, 50, 100 мл; кофемолка; цилиндры мерные на 100 и 500 мл; делительные воронки.
Ход определения. Измельченную пробу массой 50,0 г помещают в колбу на 500 мл с притертой пробкой, заливают 150 мл смеси ацетон-вода (85 + 15). Колбу закрывают пробкой и встряхивают на шуттель-аппарате в течение 45 мин. Полученный экстракт отфильтровывают через бумажный фильтр в мерный цилиндр на 100 мл, отбирая первые 75 мл фильтрата, которые переносят в делительную воронку на 500 мл. Цилиндр ополаскивают 5 мл ацетона и сливают в ту же делительную воронку. К фильтрату приливают 50 мл гексана, закрывают пробкой и энергично встряхивают
    1. 2 мин. Затем в делительную воронку приливают 150 мл 4%-ного раствора натрия хлорида, аккуратно перемешивают содержимое воронки и дают слоям разделиться. После этого нижний водно-ацетоновый слой сливают во вторую делительную воронку и в ней проводят переэкстракцию токсинов из водного ацетона в бензол или хлороформ.

При использовании хлороформа 25 мл его приливают в делительную воронку, аккуратно перемешивают и дают слоям разделиться. После разделения слоев нижний слой фильтруют в колбу на 250 мл через бумажный фильтр со слоем безводного натрия сульфата. Операцию переэкстракции повторяют еще трижды, каждый раз сливая нижний слой в ту же колбу. После этого промывают фильтр 10 мл хлороформа, полученный объединенный экстракт упаривают на водяной бане до 5 мл и используют для очистки на хроматографической колонке.
При переэкстракции афлатоксинов из водного ацетона в бензол в делительную воронку с экстрактом после обезжиривания гекса- ном вносят 25—30 мл бензола, встряхивают и после разделения слоев нижний слой отбрасывают, а бензольный экстракт, оставшийся в воронке, сливают в колбу на 100 мл. Делительную воронку промывают 10 мл бензола и сливают в ту же колбу. Объединенный бензольный экстракт упаривают на водяной бане, растворяют в 5 мл хлороформа и используют для очистки на хроматографической колонке.
В нижнюю часть хроматографической колонки помещают ватную пробку, вносят силикагель (высота столбика 1 см) и на силикагель наслаивают алюминия оксид (высота столбика 2,0—2,5 см), на который помещают слой безводного натрия сульфата высотой
  1. см. Колонку по мере наполнения обстукивают для лучшего уплотнения сорбентов.

В колонку количественно переносят упаренный до 5 мл экстракт, дают ему впитаться и элюируют токсины 100 мл смеси хлороформ-ацетон (9:1). Из колбы Бунзена элюат количественно переносят в колбу Эрленмейера на 200 мл и упаривают на водяной бане до 4—5 мл.
Упаренный экстракт количественно переносят в мерную пробирку на 10 мл и хлороформом доводят объем до метки (основной раствор). Полученный экстракт используют для тонкослойной хроматографии.
Тонкослойная хроматография. На пластинке отмечают линию старта в 1,5—2,0 см от нижнего края пластинки и наносят 20, 5, 2, 1 и 20 мкл из основного раствора (пробы 1, 2, 3, 4 и 5 соответственно). На ту же пластинку в пятно основного раствора пробы вносят 5 мкл стандартного раствора смеси афлатоксинов и рядом наносят на пластинку пробу стандартного раствора афлатоксинов в количестве 5 мкл (концентрация афлатоксинов В і и в і в стандартном растворе должна быть 1 мкг/мл и по 0,5 мкг/мл для афлатоксинов В2 и Су. Пластинку подсушивают на воздухе для удаления растворителя и проводят последовательную хроматографию в двух системах растворителей. Сначала пластинку помещают в камеру, насыщенную парами системы толуол—этилацетат 85%-ная муравьиная кислота (5:4:1). Когда фронт растворителя поднимется на 10 см над линией старта, пластинку вынимают из камеры, подсушивают на воздухе и помещают в камеру с системой хлороформ-метанол (99 : 1) и разгоняют в том же направлении на расстоянии 13 см от линии старта[4]. Пластинку просматривают в УФ-лучах (365 нм). Ш" афлатоксинов В1, В2, в) и 02 равно соответственно 0,34; 0,29; 0,26 и 0,22.
Вместо системы хлороформ—метанол (99 : 1) можно использовать систему четыреххлористый углерод—ацетон—уксусная кислота (20 : 10 : 1). Ш" афлатоксинов в этом варианте будет 0,38, 0,35, 0,33 и 0,29 соответственно для Ві, В2, О і и Ог-
Если в пробе 4 отмечается интенсивная флуоресценция, соответствующая по величине Ш" и характеру свечения стандарту, делают разведение основного раствора в 50 раз. Для этого 0,1 мл основного раствора переносят в мерную пробирку на 5 мл и доводят объем раствора до метки хлороформом. Из приготовленного раствора на пластинку наносят 10 и 5 мкл (пробы 6 и 7) и проводят последовательную хроматографию, как описано выше. Концентрацию афлатоксинов определяют по таблице 58.
Для более точного определения афлатоксинов в образце готовят разведение основного раствора в 2, 5 и 10 раз или более и из при-

Номер пробы, в которой отмечают флуоресценцию

Концентрация В| и С| (мкг/кг)

1

10-20

2

gt; 20

3

gt; 50

4

gt; 100

6

gt; 500

7

gt; 1000


готовленного раствора наносят на пластинку постепенно увеличивающиеся в объеме пробы. После разгонки пластинки в хроматографических камерах ее проявляют в УФ-лучах, отмечая наименьший объем пробы, дающий на пластинке минимальную флуоресценцию. Концентрацию каждого афлатоксина вычисляют по формуле
1,2 -200- V 1Уп
где х — концентрация афлатоксинов В[ или 0|, мкг/кг; 1,2 — коэффициент, учитывающий потери определяемых веществ в ходе анализа; 200 — коэффициент пересчета токсина на 1 кг корма с учетом минимально детектируемых количеств афлатоксина на пластинке; V — конечный объем основного раствора с учетом разведений, мл; \?— масса навески образца, соответствующего экстракту, вносимого на колонку, г; и — объем пробы, дающий на пластинке минимальную флуоресценцию, мкл.
Клиническое значение. Обнаружение в кормах афлатоксинов в количествах, превышающих 100 мкг/кг, служит основанием для постановки предварительного диагноза на отравление этими микотоксинами, особенно в случаях отравления уток, индеек, кроликов или форели. Однако окончательный диагноз может быть поставлен по результатам анамнестического расследования (содержание в корме арахисового шрота, кукурузы, ввезенных из тропических стран) и результатов патологоанатомического вскрытия (увеличение печени и почек, гемморагии, отечность, множественные кровоизлияния, некротические очаги в печени).
  1.  
<< | >>
Источник:   И. П. Кондрахин.   Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник — М.: Колос,. — 520 с.. 2004

Еще по теме   Количественное определение афлатоксинов В( и G( в кормах. Метод разработан Н. А. Соболевой.  :

  1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КЛАССОВ ЛИПИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ  
  2. Определение соединений азота в почве, воде и кормах
  3. Определение тяжелых металлов в почве, воде и кормах
  4. Количественный метод копрооволарвоскопии и подсчет количества яиц и личинок гельминтов в г фекалий
  5. Определение сапонинов в растениях и кормах (гемолитическая проба)
  6.     Определение нитритов в кормах, крови и патологическом материале с использованием реактива Грисса.  
  7.   Определение нитратов в кормах, крови, молоке и патологическом материале с использованием реактива Грисса.  
  8. Афлатоксины
  9.   МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНОВ  
  10.   Определение активности а-амилазы в сыворотке крови, моче, дуоденальном содержимом амилоклассическим методом со стойким крахмальным субстратом (метод Каравея).  
  11.   МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ  
  12. Разработка метода, определения остаточных количеств препаратов.