Задать вопрос юристу
 <<
>>

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КЛАССОВ ЛИПИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ  

Для количественного определения отдельных классов липидов используют готовый экстракт липидов, выделенный по методу Фолча, или берут пробы натуральных биосубстратов и поступают, как описано ниже.
    Определение содержания фосфолипидов (по Бартлетту—Ушеру).  Принцип.
Метод основан на минерализации липидов с помощью хлорной кислоты. Неорганический фосфор, взаимодействуя с аммония молибдатом, образует фосфомолибденовую кислоту, которую восстанавливают эйконогеном и натрия пиросульфитом в молибденовую синь. По степени окраски, определяемой колориметрически, вычисляют количество неорганического фосфора, содержащегося в фосфолипидах. Фосфолипиды стабильны в сыворотке или в плазме крови в течение 1 дня при комнатной температуре, 1 нед при хранении в холодильнике.
Реактивы: экстракционная смесь Фолча (хлороформ-метанол, 2 : 1);
72 %-ная хлорная кислота (НСЮ4) или смесь равных объемов 60%-ной хлорной и 95—97%-ной серной кислот (плотность 1,84);
5%-ный раствор аммония молибдата [ЫН4)б • М07О24 • Н2О];
сульфит-сульфоновый реактив. 13 г пиросульфита натрия (№28205), 0,5 г сульфита натрия (Ка280з) и 0,25 г эйконогена (1-амино-2-нафтол-4-сульфоновая кислота) растворяют в 100 мл дистиллированной воды (перегнанной в стеклянном дистилляторе) при постоянном встряхивании в течение 1 ч. Фильтруют через бумажный фильтр (лучше через синтетический № 4) и хранят в темной склянке. Реактив готовят еженедельно.
Оборудование: ФЭК или спектрофотометр; песчаная баня; водяная баня; колбочки плоскодонные на 50 и 100 мл; воронки; пробирки с притертыми пробками и делениями на 10 мл; пипетки.
Ход определения. Для анализа берут 0,5 мл сыворотки крови, 0,5 г гомогената тканей или 0,2—0,4 г желтка и экстрагируют по методу Фолча. В две параллельные пробирки вносят экстракт липидов в объеме, соответствующем 0,1 мл сыворотки крови, 0,02 г тканей или 0,01 г яичного желтка, добавляют по 0,6 мл хлорной кислоты и ставят на песчаную баню для сжигания при 180 °С.
После просветления содержимого (через 1—1,5 ч) пробирки охлаждают и, тщательно перемешивая, последовательно добавляют следующие реактивы: по 4 мл дистиллированной воды, по 0,2 мл сульфит-сульфонового реактива и по 0,2 мл раствора аммония мо- либдата. Затем пробирки закрывают и помещают в водяную баню при 100 °С на 10 мин. После охлаждения колориметрируют при длине волны 660 или 830 нм в кюветах с толщиной слоя 0,5—1 см против контрольной пробы (без липидов).
Расчет ведут по калибровочному графику, для построения которого используют двузамещенный фосфорнокислый калий (К2НРО4), высушенный до постоянной массы. 2,194 г реактива растворяют в 500 мл бидистиллированной воды. 1 мл раствора содержит 1 мг фосфора. Из основного раствора готовят рабочий раствор путем 50-кратного разведения водой (в 1 мл содержится 20 мкг фосфора). Если определение оптической плотности проводят на ФЭКе, то калибровочный график строят в пределах от 0,2 до 20 мкг, если же на спектрофотометре, то от 5 до 60 мкг фосфора (табл. 21).
21. Приготовление растаоров для иостроеиия калибровочного графика

№ пробирки

Рабочий раствор К2НРО4, мл

Бидистиллированная вода, мл

Концентрация фосфора, мкг/мл

1

0,1

9,9

0,2

2

0,3

9,7

0,6

3

0,5

9,5

1,0

4

2,5

7,5

5,0

5

5,0

5,0

10,0

6

7,5

2,5

15,0

7

10,0


20,0


Из каждого разведения берут по 2 мл калибровочного раствора, вносят в 2—3 параллельных пробирки и далее проделывают все операции, как описано выше.
На основании полученных данных строят калибровочный график.
Содержание общих фосфолипидов обычно выражают через количество содержащихся в них фосфатов — в ммоль/1 л, содержание отдельных фракций — также через содержание фосфатов или в процентах по отношению к сумме фосфора всех фосфолипидов.

Пересчет фосфора в фосфолипидах путем умножения на 25 нельзя признать правильным, так как это соответствует только для фос- фотидилхолинов (лецитинов), в молекуле которых содержится 4 % фосфора. В других подклассах фосфолипидов доля фосфора иная.
Клиническое значение. Фосфолипиды поступают в кровь главным образом из печени, поэтому их уровень тесно связан с функциональным состоянием данного органа. Концентрация общих фосфолипидов в норме составляет у крупного рогатого скота 170—250 мг/100 мл, у свиней — 90—200 мг/100 мл. Повышение концентрации фосфолипидов в сыворотке крови отмечается при стеотозе (жировой дегенерации) печени, тяжелой форме сахарного диабета, нефрозе и нефрите, постгеморрагической анемии. Снижение уровня фосфолипидов — частый признак острого и хронического гепатита различной этиологии; оно отмечается также при неполноценном кормлении, особенно белково-витаминной недостаточности, при дисбалансе аминокислот в рационе, алиментарной дистрофии, анемиях.
Определение содержания триацилглицеринов (по Сардесаю и Маннингу). Принцип. Метод представляет собой модификацию метода Ван-Ханделя и Зильверсмита (1957) для прямого определения триацилглицеринов. Глицерол, освобожденный омылением, окисляется до формальдегида, концентрация последнего определяется колориметрически с применением реакции Hantzsch. Данный метод позволяет выявить триацилглицерины во всех биологических субстратах — сыворотке крови, печени, мышцах, жировой ткани и др.
Кровь с гепарином или с ЭДТА может храниться в вакуумной пробирке в течение 8 ч. Пробы не замораживают.
Реактивы: экстрагирующая смесь (хлороформ-метанол 2 : 1 или спирт-эфир 3:1);
кремниевая кислота (силикагель), активированная при 105 °С в течение 10—12 ч;
спиртовой раствор калия гидроксида (КОН). 2 г КОН растворяют в минимальном количестве дистиллированной воды и объем доводят 95%-ным этиловым спиртом до 100 мл (основной раствор). Для приготовления рабочего раствора 10 мл основного раствора доводят 95%-ным этиловым спиртом до 50 мл (готовят в день применения);
0,1 моль/л раствор серной кислоты;
0,05 моль/л раствор метперйодата (NalO^;
0,5 моль/л раствор натрия арсенита (NaAs02); ацетил-ацетоновый реактив, pH 6,0 при 25 °С. 150 г аммония ацетата, 3 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл ацетил-ацетонового реактива растворяют в 1 л дистиллированной воды. Реактив стоек в течение 2 нед при хранении в холодильнике;
1%-ный стандартный раствор триацилглицеринов. 1 г триолеи- на или оливкового масла растворяют в 100 мл хлороформа. Хранят в холодильнике, стоек 2 мес.
Оборудование: спектрофотометр или ФЭК; водяная баня; пробирки обычные и центрифужные с делением; колбочки или пробирки на 10 мл; делительные воронки на 25 и 50 мл.
Ход определения. 0,1мл сыворотки (плазмы) вносят в колбочку, заливают экстрагирующей смесью и тщательно перемешивают. Через 2—3 мин содержимое пропускают через обезжиренный бумажный фильтр в мерную колбочку, доводят объем экстрагирующей смесью до 10 мл. В делительную воронку на 25 мл вносят 8 мл дистиллированной воды и 8 мл фильтрата (что соответствует 0,08 мл сыворотки). Содержимое хорошо перемешивают, отстаивают и нижний слой пропускают через стеклянную колонку размером 0,8 х 16 см (для задержки фосфолипидов), приготовленную следующим путем: в центрифужную пробирку со спиленным дном помещают кусочек стеклянной ваты и 0,5 г активированной кремовой кислоты. Перед использованием колонку промывают
  1. мл хлороформа. Фильтрат пробы собирают в мерную колбочку на 10 мл или пробирку с делениями. Колонку промывают хлороформом, который также собирают в колбочку. Объем доводят хлороформом до метки. Затем в 3 пробирки вносят по 3 мл фильтрата (что соответствует 0,024 мл сыворотки или плазмы) и после выпаривания растворителя в водяной бане в первые две пробирки добавляют по 0,5 мл спиртового раствора КОН (омыляемые пробы), а в третью — 0,5 мл спирта (неомыляемая проба). Пробирки инкубируют в водяной бане 15 мин при 60 °С. В конце инкубации в каждую из них добавляют по 0,5 мл 0,2 н. раствора серной кислоты, а затем по 0,1 мл 0,05 моль/л раствора метперйодата натрия (для окисления глицерина, освобожденного омылением).

Через 10 мин (точно!) окисление приостанавливают добавлением по 0,1 мл 0,5 моль/л раствора натрия арсенита. Через 5—7 мин, когда испарится осводившийся йод, пробирки извлекают из бани и в них добавляют по 0,8 мл воды и по 2 мл ацетил-ацетонового реактива. Содержимое тщательно перемешивают перевертыванием пробирки и инкубируют в водяной бане при 58 °С в течение 10 мин. Затем пробирки охлаждают до комнатной температуры и колориметрируют при длине волны 412 нм в кювете с толщиной слоя 0,5 см против контроля.
Степень поглощения омыляемой пробы минус степень поглощения неомыляемой пробы соответствует количеству триацилглицеринов, содержащихся в 0,24 мл исходного объема сыворотки (плазмы) крови. В используемом объеме сыворотки (плазмы) крови показания неомыляемых проб обычно очень малы и не имеют существенного значения.
Расчет ведут по формуле или калибровочному графику, который строят в пределах от 10 до 250 мкг/мл триацилглицеринов.
х (,Еоп/Е„) Сст,
где х — количество триацилглицеринов, мкг%; Еоп — экстинкция опытной пробы; Е„ — экстинкция стандартной пробы; Сст — концентрация триолеина в стандартном растворе, мг%.
Из основного раствора готовят серию рабочих калибровочных растворов (табл. 22).
22. Приготовление рабочих калибровочных растворов

N° пробирки

Стандартный раствор, мл

Хлороформ, мл

Концентрация триацилглицеринов, мкг/мл

1

0,1

9,9

10

2

0,5

9,5

50

3

1,0

9,0

100

4

1,0

4,0

200

5

1,0

3,0

250


В 5 опытных пробирок вносят по 1 мл каждого рабочего раствора и в шестую пробирку — 1 мл хлороформа для контроля на реактивы. Все пробирки помещают в кипящую баню на 10 мин для удаления хлороформа. Затем в них добавляют по 0,5 мл спиртового раствора калия гидроксида и процедуру продолжают, как описано выше.
Примечания. 1. Для анализа лучше использовать плазму крови, полученную на холоде, так как при получении сыворотки происходит частичный гидролиз триацилглицеринов. 2. В качестве антикоагулянта применяют ЭДТА натриевой или калиевой соли (1 мг на 1 мл крови). Гепарин применять не следует, так как он активирует липопротеидную липазу, гидролизирующую триацилглицерины.
Клиническое значение. Концентрация триацилглицеринов (нейтральных жиров) в сыворотке крови животных повышается при скармливании кормов, обогащенных жирами или богатых легкодоступными углеводами (картофель, зерно кукурузы, пшеницы и др.), активизирующих липогенез в печени (у моногас- тричных). Недостаток в рационах протеина и липотропных веществ (холина, метионина, треонина, селена, витамина Е, никотиновой кислоты и др.) также сопровождается нарастанием уровня нейтральных липидов в сыворотке крови животных. Увеличение концентрации триацилглицеринов отмечается при острых гепатитах, жировой дистрофии печени, нефрозах, диабете. Снижение их концентрации наблюдается при низком уровне кормления животных, усиленной молокоотдаче.
Нормативы содержания триацилглицеринов в сыворотке крови животных приведены в приложении 5.
 
<< | >>
Источник:   И. П. Кондрахин.   Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник — М.: Колос,. — 520 с.. 2004 {original}

Еще по теме КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КЛАССОВ ЛИПИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ  :

  1. З.З.6.З.              РАЗДЕЛЕНИЕ ЛИПИДОВ НА КЛАССЫ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ (ТСХ) 
  2.   Количественное определение афлатоксинов В( и G( в кормах. Метод разработан Н. А. Соболевой.  
  3. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОДУКТОВ ПЕРЕКИСНОГО (СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО) ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ  
  4.   Метод экстракции липидов спиртово-эфирной смесью (по Блюру).  
  5. Количественный метод копрооволарвоскопии и подсчет количества яиц и личинок гельминтов в г фекалий
  6.   ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА КОРМОВ  
  7.   Определение активности а-амилазы в сыворотке крови, моче, дуоденальном содержимом амилоклассическим методом со стойким крахмальным субстратом (метод Каравея).  
  8.   МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНОВ  
  9. Часть 2 ВИДЫ УДОБРЕНИЙ, ИХ ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ И СВОЙСТВА, УСЛОВИЯ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ И МЕТОДЫ ОПТИМИЗАЦИИ ДОЗ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
  10.   МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНОВ  
  11.   МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ  
  12.   Определение ФОП методами ГЖХ.