<<
>>

  Метод экстракции липидов спиртово-эфирной смесью (по Блюру).  

  Принцип. Метод аналогичен предыдущему, но для экстракции применяют смесь других полярных (этиловый спирт) и неполярных (диэтиловый эфир) растворителей. В результате данный метод не обеспечивает полной экстракции фосфолипидов, ганглиозидов и протеолипидов.

Реактивы: смесь этилового эфира и диэтилового эфира (3 : 1); петролейный эфир.

Оборудование: пипетки на 1, 5 и 10 мл; колбочки с притертой пробкой на 50 и 100 мл; воронки; пробирки с притертой пробкой; бумажные фильтры; роторный испаритель; водяная баня; аналитические весы.

Ход определения.

В плоскодонную колбу вносят необходимый объем сыворотки крови (1—3 мл или больше) или несколько граммов гомогената тканей, заливают 20 объемов спирто- во-эфирной смеси, перемешивают и оставляют на 12 ч при комнатной температуре. Экстракцию можно ускорить кратковременным подогревом (2—3 мин) при температуре 40 °С. Липидный экстракт отфильтровывают от выпавшего белка и концентрируют выпариванием на роторном испарителе. Затем липиды экстрагируют тремя порциями петролейного эфира, отбрасывая нерастворимый осадок. Концентрацию липидов в экстракте определяют взвешиванием одним из изложенных выше методов.

Экстракт используют для определения главным образом холестерина и триацилглицеринов, поскольку фосфолипиды экстрагируются не полностью.

Клиническое значение. Физиологическая гипер- липемия отмечается через 1—3 ч после скармливания животным кормов, обогащенных липидами, а также у кур, индеек, уток, гусей и других птиц (самок) в период их полового созревания, подготовки к яйцекладке и в период интенсивной продуктивности. Патологическая гиперлипемия наблюдается у коров с патологией обмена веществ и алиментарным бесплодием, при концентратом типе кормления, ожирении, остром и хроническом гепатите, хроническом нефрите, гипофункции щитовидной железы, передней ДОЛИ гипофиза, недостаточной активности сывороточной липопротеиновой липазы (ЛПЛ), расщепляющей триацилглицерины сыворотки крови (фактор просветления).

Концентрация общих липидов в сыворотке крови в норме составляет у крупного рогатого скота 280—600 мг/100 мл, у свиней — 350—400, кур 360—2100 мг/100 мл.

Источник: 57.

Определение общих липидов в сыворотке крови с сульфофосфова- нилиновым реактивом (по Цёлнеру—Киршу в изложении Л.

В. Орлова). Принцип. Метод основан на цветной реакции продуктов распада ненасыщенных липидов в серной кислоте с реактивом, состоящим из ванилина и ортофосфорной кислоты. Механизм цветной реакции заключается в том, что ненасыщенные липиды реагируют с серной кислотой при нагревании с образованием карбо- ниевого иона, взаимодействие которого с активированной карбоксильной группой ванилина фосфата образует стабильный комплекс. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию общих липидов в сыворотке крови.

Реактивы: серная кислота (Н3804) концентрированная (х. ч.) или для пробы Соваля;

ортофосфорная кислота (Н3Р04) концентрированная;

ванилин (х. ч.), 0,6%-ный раствор. 0,6 г ванилина растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды с нагреванием на водяной бане, после охлаждения доводят объем до 100 мл. Раствор стабилен при хранении при комнатной температуре;

фосфор-ванилиновый реактив. 4 части ортофофорной кислоты смешивают с 1 частью 0,6%-ного раствора ванилина. Хранят в темной склянке при комнатной температуре;

хлороформ (х. ч. или для наркоза);

стандартный раствор в хлороформе триолеина или холестерина (х. ч.) со свежим топленым и профильтрованным сливочным маслом в соотношении 1: 3 или общие липиды, выделенные из сыворотки крови или печени. Взвешивают на аналитических весах 1200 мг триолеина или других указанных липидов и растворяют в мерной колбе на 100 мл. Хранят в темной склянке с притертой пробкой в холодильнике.

Оборудование: ФЭК или спектрофотометр; водяная баня; термостат; колбы мерные; пипетки; пробирки.

Ход определения. В пробирки (высотой 15 см) с 0,01 мл сыворотки крови добавляют 0,5 мл концентрированной серной кислоты. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и ставят в кипящую водяную баню или термостат при температуре 130 °С на 20 мин. Водяная баня должна быть заполнена водой не ниже уровня жидкости в пробирках, поставленных в нее. Используемые для анализа пробирки и другую посуду моют отдельно, тщательно ополаскивают дистиллированной водой и спиртом.

Через 20 мин пробирки охлаждают под водопроводной водой, приливают 1,5 мл сульфофосфованилинового реактива, тщательно встряхивают и выдерживают в темноте при комнатной температуре 45 мин. Содержимое пробирки постепенно меняет желтый цвет на красный, который стабильно удерживается до 18 ч.

Через 1 ч определяют оптическую плотность на ФЭКе или спектрофотометре при зеленом фильтре (500—560 нм) в кювете с толщиной слоя 0,5—1 см против холостой пробы. Холостую пробу готовят так же, как и опытную, но вместо сыворотки берут 0,01 мл воды. Если концентрация липидов низкая и недостаточно улавливается на ФЭКе, то для исследования берут двойную дозу сыворотки (0,02 мл).

Расчет ведут по калибровочному графику. Для его построения из стандартного раствора триолеина готовят рабочие калибровочные растворы (табл. 20).

20. Приготовление рабочих растворов для построения калибровочного графика

N° пробирки

Стандартный раствор триолеина, мл

Хлороформ, мл

Концентрация общих липидов, мг%

1

0,17

0,83

200

2

0,33

0,67

400

3

0,50

0,50

600

4

0,67

0,33

800

5

0,83

0,17

1000

6

1,00

1200

Берут по 0,01 мл каждого разведения калибровочного раствора и выполняют все операции, как с опытными пробами (обязательно выдерживают в водяной бане точно так же, как и пробирки с исследуемой сывороткой). В противном случае цветная реакция с сульфофосфованилиновым реактивом не наступает или будет очень слабой, нехарактерной. Холостую пробу с дистиллированной водой можно не выдерживать в водяной бане.

На основании полученных данных строят калибровочный график.

Прямолинейная зависимость между концентрацией общих липидов и оптической плотностью сохраняется до 1200 мг%. Поэтому при большей концентрации сыворотку крови разводят физраствором и результаты умножают на разведение.

Для определения этим методом содержания общих липидов в тканях животных необходимо свежую или замороженную ткань подвергнуть деемолизу в 33%-ном растворе калия гидроксида* В пробирку помещают 200 или 300 мг ткани, прибавляют 3 мл 33%-ного калия гидроксида и выдерживают на кипящей водяной бане 60—120 мин, периодически встряхивая. Содержимое пробирок доводят дистиллированной водой до 5 мл и тщательно перемешивают. Из этого содержимого берут 0,2 мл в другую пробирку, приливают 1 мл серной кислоты и кипятят в бане или выдерживают в термостате при температуре 130 °С в течение 20 мин. После охлаждения приливают 2 мл сульфофосфованилиновой смеси и дальнейшие операции проводят так же, как описано выше с сывороткой крови. Однако в этом случае при исследовании на ФЭКе удобнее пользоваться кюветами с толщиной слоя 0,5 см. Сравнение определения концентрации общих липидов в известных стандартных растворах и в пробах, проводимое различными методами, показало высокую точность и воспроизводимость результатов.

Источник: 6, 29, 57.

  1.  
<< | >>
Источник:   И. П. Кондрахин.   Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник — М.: Колос,. — 520 с.. 2004

Еще по теме   Метод экстракции липидов спиртово-эфирной смесью (по Блюру).  :

  1. З.З.6.З.              РАЗДЕЛЕНИЕ ЛИПИДОВ НА КЛАССЫ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ (ТСХ) 
  2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КЛАССОВ ЛИПИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ  
  3. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОДУКТОВ ПЕРЕКИСНОГО (СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО) ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ  
  4. Взаимодействие токсикантов с липидами. 
  5. 5.11. Эфирные взрывы. Тунгусский метеорит
  6. Эфирная и физическая материи
  7. Взаимодействие эфирных полей тел. Эффект Казимира
  8. Токсические растения, содержащие эфирные масла
  9. РОЛЬ ЭФИРНЫХ МАСЕЛ В УСТОЙЧИВОСТИ ЛУКА К ПОРАЖЕНИЮ МИКРООРГАНИЗМАМИ
  10. Эфирная модель строения атома