<<
>>

  Метод неферментативного определения лактата и пирувата в одной пробе крови.  

  Пр и н ц и п. В основу метода определения лактата положена способность молочной кислоты превращаться в ацетоальдегид, который дает с гидрохиноном красно-коричневое окрашивание. В щелочной среде пируват с п-диметиламинбен- зальдегида (п-ДБА) образует комплекс желтого цвета.

Условия взятия образца крови, хранения и исследования такие же, как и при определении лактата.

Реактивы: 10%-ный раствор Н2РО3. Хранят не более 3 дней;

25%-ный раствор C11SO4 • 5НгО;

10%-ный раствор C11SO4 • 5Н2О;

Са(ОН)2 в порошке (ч.

д. а.);

концентрированная H2SO4;

20%-ный спиртовой раствор гидрохинона;

раствор п-диметиламинбензальдегида (п-ДБА): 500 г п-ДБА в 60 мл метилсульфоксида, дистиллированная вода до 100 мл;

25%-ный раствор NaOH.

Оборудование: водяные бани на 37 °С и 100 °С; центрифуга ОПН-8; спектрофотометр СФ-46; центрифужные пробирки; пробирки с притертыми пробками; пипетки.

Ход определения. В центрифужную пробирку вносят

  1. мл дистиллированной воды и 1 мл взятой крови, 1 мл 10%-ного раствора Н2РО3, хорошо встряхивают и оставляют на 2 мин для осаждения белков. Центрифугируют 5 мин при 2000—3000 мин-1. Прозрачную надосадочную жидкость переносят в чистую центрифужную пробирку, приливают 1 мл 25%-ного раствора C11SO4 и вносят 0,5 г Са(ОН)2, тонко растертого до порошка. Стеклянной палочкой перемешивают пробы, пока голубая окраска не перейдет в синюю. Через 30 мин центрифугируют пробу 10 мин при 2000—3000 мин 1. Полученный безбелковый центрифугат переносят в градуированную пробирку для определения коэффициента К измерения объема анализируемого раствора:

К= V/v,

где V — общий объем анализируемого раствора (кровь, вода, осадители белков и углеводов), мл; v — объем безбелкового и безуглеводного центрифугата, мл.

Для определения пирувата (Р) в центрифужную пробирку вносят 1 мл анализируемого раствора (в контроль — 1 мл воды), 3 мл реактива п-ДБА и 1 мл 25%-ного раствора NaOH. Тщательно перемешивают реакционную смесь и помещают в водяную баню при 37 °С на 45 мин.

Во время термостатирования смеси с пируватом параллельно определяют содержание лактата. Для этого в центрифужную пробирку с притертой пробкой вносят 1 мл прозрачного центрифуга та

  Рис. 2. Калибровочные кривые для определения лактата и пирувата:

  Рис. 2. Калибровочные кривые для определения лактата и пирувата:

По оси абсцисс — концентрация (ммоль/л) лактата (сплошная линия), концентрация (мкмоль/л) пирувата (пунктирная линия); по оси ординат — оптическая плотность, относительные единицы

(в контроль — 1 мл воды), добавляют по 0,1 мл 10%-ного раствора C11SO4 и осторожно по стенке приливают по 4 мл концентрированной H2SO4, хорошо закрывают пробкой во избежание испарения образовавшегося в результате реакции ацетальдегида. Смесь помещают в кипящую водяную баню на 1,5 мин. После кипячения и охлаждения вносят 0,1 мл спиртового раствора гидрохинона,перемешивают, повторно помещают в кипящую водяную баню на 15 мин и охлаждают. Охлажденный раствор колориметрируют при длине волны 430 нм против контроля. Содержание лактата рассчитывают по калибровочной кривой с учетом коэффициента К (рис. 2).

По истечении 45 мин термостатирования реакционную смесь с пируватом центрифугируют при 2000—3000 мин-1 и осторожно переносят надосадочную жидкость в спектрофотометрические кюветы для определения оптической плотности анализируемого раствора (при 420 нм) против контроля. Концентрацию пирувата рассчитывают по калибровочной кривой с учетом коэффициента К.

Для построения калибровочных графиков используют растворы лактата и пирувата с разведением 1 : 8, обрабатывая их аналогично центрифугату. Концентрацию лактата и пирувата в крови рассчитывают путем умножения величин, полученных по калибровочным кривым, на коэффициент К.

Источники: 8, 16, 33.

 

<< | >>
Источник:   И. П. Кондрахин.   Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник — М.: Колос,. — 520 с.. 2004

Еще по теме   Метод неферментативного определения лактата и пирувата в одной пробе крови.  :

  1.   Определение активности а-амилазы в сыворотке крови, моче, дуоденальном содержимом амилоклассическим методом со стойким крахмальным субстратом (метод Каравея).  
  2.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЗЕРВНОЙ ЩЕЛОЧНОСТИ КРОВИ ДИФФУЗНЫМ МЕТОДОМ ПО И. П. КОНДРАХИНУ  
  3.   Определение марганца в крови перйодатным методом.  
  4.   Определение белковых фракций в сыворотке крови турбидимет- рическим (нефелометрическим) методом.  
  5.   Определение общего белка в сыворотке крови рефрактометрическим методом.  
  6.    Флуориметрический метод определения общего тиамина в крови и печени (по Г. Д. Елисеевой).  
  7.   Определение свободного аминного азота в сыворотке крови по методу Г. А. Узбекова в модификации 3. С. Чулковой.  
  8.   Определение кетоноиых тел в крови йодометрическим методом.  
  9.   Определение токоферолов в тканях и сыворотке крови методом колоночной хроматографии. 
  10.   Определение билирубина в сыворотке крови животных по методу Ендрассика—Клеггорна—Грофа в модификации В. И. Левченко и В. В. Влизло. 
  11.   Определение билирубина в сыворотке крови по диазореакции (метод Ендрассика—Клеггорна—Грофа).  
  12.   Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови по гидролизу р-глицерофосфата (метод Бодански).  
  13.   Определение активности сорбитолдещдрогеназы (СДГ) в сыворотке крови по реакции с резорцином (метод Севела—Товарека).