<<
>>

  МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ ПЕСТИЦИДОВ  

  Отравления сельскохозяйственных животных и птиц фосфор- органическими пестицидами (ФОП) чаще всего бывают при их применении для обработки животных с целью защиты от насекомых и клещей в результате завышения доз и концентраций препаратов, а также образования токсичных продуктов в процессе их хранения (нарушение герметизации емкостей, проникновение в них влаги и другие причины).
Значительно реже регистрируют отравления животных при использовании ФОП для защиты растений, так как животные не поедают обработанные растения из-за неприятного запаха большинства пестицидов этой группы. Однако при обработке растений вблизи пасек отмечены случаи гибели пчел, которые очень чувствительны к фосфорорганическим инсекто-акарицидам. ФОП в окружающей среде довольно быстро разрушаются и сравнительно не токсичны для рыбы, поэтому отравления рыбы и других гидробионтов пестицидами этой группы сравнительно редки. Отмечены лишь случаи гибели рыбы в результате сброса в рыбоводные водоемы плохо очищенных сточных вод заводов, произвол дящих ФОП.

В настоящее время зарегистрированы и разрешены к применению в качестве средств защиты растений и животных следующие ФОП: актеллик, пиримифосметил; антио; препараты на основе диазинона (базудин, неоцидол, диозол) и фосфамида (БИ-58, ди- метоат); байтекс; хлорофос (негувон, трихлорфон); циодрин; фоза- лон; карбофос (малатион).

Для определения ФОП в патологическом материале, кормах, препаративных формах с целью постановки диагноза на отравление наибольшее распространение получили методы на основе тонкослойной (ТСХ) и газожидкостной хроматографии (ГЖХ).

Определение ФОП методом ТСХ. Для определения ФОП методом ТСХ в качестве проявляющих реагентов используют смеси различных химических соединений, таких, как ацетоновые растворы бромфенолового синего и азотнокислого серебра с последующей обработкой пластинки лимонной кислотой; 0,7%-ный раствор

    1. дибром-М-хлорхинонимина в гексане и некоторые другие.
      Однако наибольшее применение получили методы с использованием в качестве проявляющего реагента энзимного реактива (М. В. Письменная, 1979; В. В. Карнаухов, 1985).

Принцип. Определение ФОП методом ТСХ с энзимным проявлением основано на их извлечении из пробы органическим растворителем, очистке осаждением на холоде, концентрировании экстракта, развитии соединения на пластинках с сорбентом и проявлении его с помощью реактива, содержащего фермент холинэс- теразу.

В основе использования энзимного проявителя лежит способность ФОП (производных фосфорной и фосфоновой кислот) подавлять в условиях in vitro активность фермента (энзима) холинэс- теразы. Степень ингибирования активности фермента определяют по уровню расщепления субстрата, в качестве которого используют индоксилацетат или броминдоксилацетат. Если в исследуемой пробе присутствует ФОП, он подавляет активность холинэстеразы, которая, в свою очередь, не расщепляет или слабо расщепляет субстрат. В результате этого на всей поверхности пластинки, где нет ФОП и активность фермента высокая, происходит расщепление субстрата и пластинка окрашивается в голубой цвет. В местах содержания ФОП на голубом фоне они выделяются в виде белых пятен.

Однако производные тио- и дитиокислот фосфора (фосфамид, байтекс, карбофос и некоторые другие) обладают слабой способностью подавлять активность холинэстеразы. Для того чтобы они обладали такой способностью, их активируют с помощью раствора брома, аммиака или путем облучения УФ-лучами. При определении в патологическом материале фосфамида или антио активацию проводят с помощью УФ-лучей, валексона, байтекса, карбофоса, метафоса — водным раствором брома; хлорофоса — водным раствором аммиака.

Реактивы: ацетон (х. ч.);

метилена хлорид (х. ч);

натрия сульфат безводный (ч. д. а.);

натрия тиосульфат, 25%-ный водный раствор;

гексан (х. ч.);

спирт этиловый ректификат; бром; индоксилацетат (ч.

д. а.); броминдоксилацетат (ч. д. а.);

калий железисто-синеродистый, 1,5%-ный водный раствор; калий железисто-синеродистый, 20%-ный водный раствор; буферный раствор, pH 8,69: 2,1 мл ортофосфорной, 2,3 мл уксусной и 2,47 г борной кислот помещают в колбу на 1 л и доводят до метки дистиллированной водой. К 100 мл указанной смеси добавляют 65 мл 0,2 н. раствора NaOH, который готовят растворением 0,8 г NaOH в 100 мл дистиллированной воды.

Ферментный препарат получают из печени крупного рогатого скота, уток или кур (свежезамороженную печень можно хранить в морозильной камере холодильника 4 мес). Для приготовления ферментного раствора 1 г печени растирают в ступке с 9 мл буферного раствора, фильтруют через вату. К 1 мл полученного гомогената добавляют 4 мл буферного раствора. Приготовленный препарат используют для опрыскивания пластинок. Применяют свежеприготовленный раствор.

Основной стандартный раствор ФОП готовят путем растворения 10 мг пестицида в 100 мл ацетона (100 мкг/мл). Из этого раствора готовят на ацетоне рабочие стандартные растворы от 0,01 до 0,5 мкг/мл.

Проявляющий реактив: 10 мг индоксилацетата или 5 мг бро- миндоксилацетата растворяют в 6 мл этанола, добавляют 10 мл дистиллированной воды, 2 мл 1,5%-ного водного раствора железис- то-синеродистого калия, 2 мл 2%-ного водного раствора железисто-синеродистого калия и хорошо перемешивают. Раствор готовят перед опрыскиванием.

Оборудование: камера для хроматографирования; камера для опрыскивания пластинок; пластинки для хроматографии «Силуфол» производства Чехии; отечественные пластинки «Армсорб» на фольге или стекле; «Плазмохром» на полимере; круглодонные и грушевидные колбы на шлифах на 25, 50 и 100 мл; пипетки на 1,5 и 10 мл; эксикаторы; воронки делительные на 250 и 500 мл; мерные колбы на 25 и 50 мл; баня водяная; вакуум-ротационный испаритель ИР-1; термостат; ступки керамические; компрессор или баллон с азотом или сжатым воздухом для распыления проявляющего реактива; пульверизаторы стеклянные; микрошприц на 100 мкл; микропипетки до 0,1 мл; шутгель-аппарат.

Ход определения. Юг измельченной ткани (печень, почки, мышцы) помещают в колбу с притертой пробкой и заливают 30 мл ацетона. Колбу встряхивают на шуттель-аппарате в течение

  1. ч. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в другую колбу. Остаток в колбе промывают 10 мл ацетона и фильтруют через тот же фильтр. К фильтрату добавляют 40 мл дистиллированной воды, и колбу на 20 мин помещают в морозильную камеру бытового холодильника. Охлажденную смесь фильтруют через плотный ватный томпон в делительную воронку. Остаток в колбе промывают 10 мл холодной смеси ацетон-вода (1:1) и объединяют с фильтратом. Пестициды из смеси ацетон-вода реэкстрагируют в 40 мл хлороформа, встряхивая делительную воронку в течение 2 мин.

После разделения слоев нижнюю фазу фильтруют через бумажный фильтр с помещенным на него безводным натрия сульфатом в фарфоровую чашку или колбу вакуум-ротационного испарителя. Реэкстракцию повторяют. Хлороформные экстракты объединяют и упаривают досуха в токе воздуха или с помощью вакуум-ротационно- го испарителя. Сухой остаток растворяют в 5 мл этанола (В. В. Карнаухов, 1987).

На пластинки «Силуфол» или «Плазмохром» наносят не более 30 мкл раствора экстракта, подготовленного для хроматографирования. На линию старта в том же объеме наносят стандартные растворы ожидаемых ФОП концентрацией 0,5 мкг/мл, или 15 нг в пробе. Пластинки помещают в камеру для хроматографирования, в которую за 30 мин до начала разделения заливают подвижный растворитель, который необходимо предварительно подобрать, используя стандартные растворы пестицидов. Для антио и фосфами- да может быть рекомендована подвижная система бензол-ацетон (3:2). Величина ЯГ пестицидов на «Силуфоле» соответственно составит 0,8 и 0,5. Для хлорофоса система гексан-ацетон (1:1) при величине Ііґ 0,3 при определении валексона, дурсбана, карбофоса, метафоса, метилнитрофоса, фталофоса в качестве подвижного растворителя может быть использован хлороформ.

После подъема фронта растворителя на высоту 10 см пластинки вынимают и сушат при комнатной температуре. После этого проводят активацию пестицидов: пластинки опрыскивают водным раствором брома или воздействуют на них УФ-лучами. При определении хлорофоса пластинку опрыскивают водным раствором аммиака. При применении в качестве активатора водных растворов брома через 15 мин после увлажнения пластинки избыточный бром удаляют путем легкого опрыскивания пластинки 2,5%-ным раствором натрия тиосульфата. Активацию пестицидов УФ-лучами осуществляют облучением пластинки с помощью лампы ПРК-4 с расстояния не более 20 см. При активации хлорофоса водным раствором аммиака его смешивают с 4 частями воды. Раствором пластинку опрыскивают до слабого увлажнения, после чего выдерживают в течение 15 мин при комнатной температуре. Под действием щелочи хлорофос переходит в ДДВФ, который обладает более высокой антихолинэстеразной активностью.

После активации пестицидов пластинки подсушивают при комнатной температуре, опрыскивают свежеприготовленным ферментным раствором и инкубируют в термостате, насыщенном водными парами, при температуре 38 °С в течение 40—60 мин. Для насыщения термостата парами в него ставят чашку Петри, заполненную водой. После инкубации пластинку опрыскивают проявляющим раствором и снова ставят в термостат. ФОП проявляются в виде белых пятен на голубом фоне в течение 10—30 мин.

В качестве химических проявляющих реактивов при определении антио, фосфамида, фозалона и хлорофоса на пластинках «Си- луфол» наиболее целесообразно использовать раствор серебра нитрата с 2-феноксиэтанолом. Этот проявляющий реагент готовят следующим образом: в мерной колбе на 100 мл растворяют 1 г серебра нитрата в 2 мл дистиллированной воды, добавляют в колбу 10 мл 2-феноксиэтанола и доводят объем в колбе до метки ацетоном. После этого вводят 2—3 капли пероксида водорода. Пластинки сначала опрыскивают проявляющим реактивом, а затем облучают УФ-лучами, используя лампу ПРК-4. Предел обнаружения составляет для антио, фозалона и фосфамида 0,01 мкг, для хлорофоса — 0,1 мкг. При анализе дурсбана, карбофоса, метафоса и ме- тилнитрофоса наилучшие показатели достигнуты при использовании в качестве проявляющего реагента 0,7%-ного раствора 2,6-диб- ром-1Ч-хлорхинонимина в гексане или хлороформе с последующим одновременным облучением пластинки УФ- и ИК-лучами. Предел обнаружения пестицидов составляет от 0,05 до 0,1 мкг в пробе.

Количественное определение содержания пестицидов в пробе при анализе посредством ТСХ осуществляют путем сравнения площади пятен и интенсивности их окраски при анализе экстрактов и стандартных растворов. Содержание пестицида в пробе (х, мг/кг) рассчитывают по формуле

ЛЯ, V• 1000 *=-^’

где А — содержание пестицида в стандарте, мкг; — площадь пятна пробы, мм2; К — общий объем экстракта, мл; 1000 — коэффициент для пересчета на килограммы; 5( — площадь пятна стандарта, мм2; У\ — объем экстракта, нанесенного на пластинку, мкл; Р — масса пробы, взятой для анализа, г.

 

<< | >>
Источник:   И. П. Кондрахин.   Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник — М.: Колос,. — 520 с.. 2004

Еще по теме   МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ ПЕСТИЦИДОВ  :

  1.   Определение активности а-амилазы в сыворотке крови, моче, дуоденальном содержимом амилоклассическим методом со стойким крахмальным субстратом (метод Каравея).  
  2.   МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПИРЕТРОИДОВ  
  3. Токсикология пестицидов
  4.   МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ  
  5.   Определение ФОП методами ГЖХ.  
  6.   МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНОВ  
  7.   МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНОВ  
  8.   МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕРБИЦИДОВ ГРУППЫ 2,4-Д  
  9. Техника безопасности при работе с пестицидами на виноградниках
  10.   МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛКАЛОИДОВ  
  11.   МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИАНИДОВ  
  12.   Ионометрический метод определения нитратного