Задать вопрос юристу
 <<
>>

  МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СИСТЕМЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ ОРГАНИЗМА  

  Определение активности супероксиддисмутазы (КФ.1.15.1.1) в эритроцитах. Принцип. Метод основан на торможении су- пероксидцисмутазой (СОД) восстановления бесцветных тетразоли- евых солей супероксидными анионрадикалами, при котором происходит их превращение в окрашенные соединения (формазаны).
Реактивы: 0,2 ммоль/л раствор ЭДТА-Ка.
37 г ЭДТА-1Ча (трилон Б) растворяют в 500 мл дистиллированной воды;
0,05 моль/л раствор тетраметилендиамина (ТЭМЭД). 0,28 мл ТЭМЭД растворяют в 40 мл 0,2 ммоль/л раствора ЭДТА-№. Реактив годен для использования через 2 ч после приготовления в течение 1 сут;
0,034 ммоль/л раствор рибофлавина. 1,3 мг рибофлавина растворяют при перемешивании на магнитной мешалке в течение 20—30 мин в 100 мл дистиллированной воды. Раствор хранят в склянке из темного стекла. Годен в течение рабочего дня;
0,85 ммоль/л раствор пара-нитротетразолия хлористого (п-НТХ). 32 мг п-НТХ растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Реактив растворяется медленно, поэтому следует это делать на магнитной мешалке с подогревом до 50 °С. Хранят в склянке из темного стекла в течение 1 мес;
0,1 моль/л фосфатный буфер, pH 7,8. 1,3616 г КН2РО4 растворяют в 100 мл воды; 16,036 г Ыа2НР04 • 2Н20 растворяют в 900 мл воды. К одной части раствора калия фосфата добавляют 9 частей раствора натрия фосфата и pH определяют в помощью рН-метра;
0,1 моль/л буфер, pH 9,85. Для этого половину буферного раствора с pH 7,8 оставляют, а другую половину с помощью концентрированного раствора КОН доводят до pH 9,85;
1%-ный раствор калия йодида;
0,9%-ный раствор натрия хлорида;
хлороформ-этаноловая смесь (ХЭС) в соотношении 5 : 3 (об/об.).
Оборудование: ФЭК; лампа дневного света мощностью 40 Вт, длина трубки 1 м и более; штатив для пробирок на 20—30 гнезд в один ряд, закрытый спереди и сзади черной бумагой; весы аналитические; магнитная мешалка; секундомер; центрифуга рефрижераторная; холодильник бытовой; баня водяная; колбы мерные; пипетки с делениями разные; пробирки химические и центрифужные.
Ход определения. Для исследования берут эритроциты, отмытые трижды холодным 0,9%-ным раствором натрия хлорида из 0,5 мл гепаринизированной крови, добавляют 5 мл охлажденной до 1—4 °С дистиллированной воды и ставят в ледяную баню на 15 мин для полного гемолиза. Затем 1,5 мл гемолизата переносят в центрифужные пробирки, прибавляют по 0,5 мл ХЭС, перемешивают и оставляют стоять на 10—15 мин в ледяной бане^ После этого пробирки центрифугируют при 0—4 "С и 3000 мин 1 в течение 15 мин. Надосадочную жидкость (бесцветную или слегка желтую) разбавляют дистиллированной водой в 20 раз. Половину полученного раствора (биологического материала) оставляют в химических пробирках в ледяной бане, другую половину помещают в кипящую водяную баню на 10 мин (вода должна постоянно кипеть) для инактивации фермента.
Для каждой пробы берут по три химических пробирки, ставят в закрытый штатив и добавляют в них растворы реактивов и биологический материал (табл. 31).

1

0,1 моль/л фосфатный буфер, pH 7,8

1,0

1,0

2

0,1 моль/л фосфатный буфер, pH 9,85



2,0

3

0,05 моль/л ТЭМЭД

1,0

1,0


4

0,85 моль/л п-нитратетразоля

1,0

1,0

1,0

5

Вода дистиллированная

5,0

5,0

5,0

6

Биологический материал (БМ)

0,2



7

БМ после кипячения


0,2

0,2

8

0,034 ммоль/л раствор рибофлавина

2.0

2,0

2,0

31. Порядок приготовления растворов для определения активности КФ 1.15.1.1


п/п

Реактив

Опыт,
мл

Контроль,
мл

Контроль на реактив, мл


Содержимое пробирок старательно перемешивают и штатив с ними устанавливают на расстоянии 20 см от лампы дневного света.
Включают лампу, прогревают ее в течение 10 мин. Открывают переднюю стенку штатива, облучают пробы в течение 5 мин (по секундомеру) и закрывают переднюю стенку штатива.
Во все пробирки добавляют как можно быстрее по 1 мл 1%-но- го раствора калия йодида (для остановки реакции) и сразу интенсивно перемешивают.
Измеряют оптическую плотность каждой пробы при зеленом светофильтре в кюветах с ходом луча 20 мм против дистиллированной воды.
Количество гемоглобина в гемолизатах определяют цианидным методом с помощью специальных наборов НПО «Биореактив».
Процент торможения СОД образования фармазана п-НТХ определяют по формуле
Т= Егк~ Е°" -100,
Ек~Ещ,
где Т — процент торможения реакции; Ек — оптическая плотность контрольной пробы; Еоп — оптическая плотность опытной пробы; Екр — оптическая плотность пробы контроля на реактивы; 100 — коэффициент для перевода в проценты.
Принято считать, что 50 % ингибирования реакции соответствует одной относительной единице (1 отн. ед.) активности фермента.
Количество отн. ед. активности фермента, внесенного в пробу, рассчитывают по формуле
м= 10(0,026 • Т— 1,3)^
где М — количество отн. ед. активности в пробе; Т — процент торможения реакции.
Активность СОД в пересчете на содержание гемоглобина рассчитывают по формуле
МЕ„
0,1236?гем ’
где А — активность фермента (СОД), ед. акт/мг гемоглобина; М — количество единиц фермента в пробе; Ест — оптическая плотность стандартного раствора, содержащего 59,75 мг гемоглобинцианида в 100 мл; ?гем — оптическая плотность опытной пробы гемолизата при определении гемоглобина.
Примечания. 1. Пробы гепаринизированной крови можно хранить при 4 °С не более 1 сут. 2. Химические пробирки, в которых ведется определение активности фермента, должны быть одинаковыми по диаметру, толщине стенок и цвету стекла. 3. В добавке биологического материала должна содержаться примерно 1 ед. активности фермента (степень торможения должна составлять 35—55 %). 4. При определении активности СОД в эритроцитах крови птиц отмытую эритроцитарную массу из 0,5 мл крови лизируют 2,5 мл холодной дистиллированной воды. Центрифугируют при 3000 мин в течение 15 мин для осаждения ядер эритроцитов. Берут 1,5 мл надосадочной жидкости и далее продолжают исследование, как указано выше.

Клиническое значение. Супероксиддисмутазавстречается во всех клетках и является ключевым ферментом антиокси- дантной защиты в организме, которая попарно дисмутирует (превращает) супероксидные анионы в пероксид водорода и молеку- _ _ 2Н+
лярный кислород (02 + 02 + -» Н2О2 + 02) и тем самым
СОД
защищает клетки от токсичных форм кислорода в самом начале процесса ПОЛ. Активность СОД в крови и печени повышается в 1,5—5 раз во всех случаях, когда в клетках нарастает концентрация
супероксидных анионов (02 ), что наблюдается при заболеваниях желудочно-кишечного тракта, легких, инфаркте миокарда и других заболеваниях сердца и сосудов, термических ожогах, болезнях печени, особенно при жировой дистрофии, при онкологических поражениях, химических отравлениях, эмоционально-болевых и других стрессах.
Снижение активности СОД отмечено при ишемии миокарда, печени, почек, скелетных мышц, хотя уровень липидных пероксидов в этих случаях возрастает. Аналогично снижается активность СОД при хроническом гепатите, фиброзе, циррозе, глубоких деструктивных поражениях печени.
Показатели активности СОД у здоровых взрослых животных и птиц колеблется от 1,0 л 7,5 ед. акт/мг гемоглобина.
Источники: 11, 26, 47.
 
<< | >>
Источник:   И. П. Кондрахин.   Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник — М.: Колос,. — 520 с.. 2004 {original}

Еще по теме   МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СИСТЕМЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ ОРГАНИЗМА  :

  1. Порядок определения показателей экономической эффективности применения удобрений:
  2. МЕТОДЫ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ ВРЕДИТЕЛЕЙ
  3. Интегрированная система защиты винограда от болезней и вредителей.
  4. VI. РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ И МЕТОДОВ ЗАЩИТЫ ЛОШАДЕЙ ОТ ГАСТРОФИЛЕЗА
  5.   Определение активности а-амилазы в сыворотке крови, моче, дуоденальном содержимом амилоклассическим методом со стойким крахмальным субстратом (метод Каравея).  
  6. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ НОВОКАИНА НА РАЗЛИЧНЫЕ СИСТЕМЫ ОРГАНИЗМА
  7. 1.5. Учет организмов как специфический метод экологии
  8. 6.1.2. Роль наследственных и средовых факторов в определении половой принадлежности организма
  9.   МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНОВ  
  10.   МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ  
  11.   МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНОВ  
  12.   МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ ПЕСТИЦИДОВ