<<
>>

  МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РОДЕНТИЦИДОВ (ЗООКУМАРИНА, БРОМАДИОЛОНА, БРОДИФАКУМА, ЦИНКА ФОСФИДА)  

  Для борьбы с грызунами на животноводческих фермах наиболее широко применяют родентициды из группы антикоагулянтов, производные 4-оксикумарина (зоокумарин, бромадиолон, броди- факум), а также препараты на основе 1,3-индандиона (дифенацин, этилфенацин, изоиндан, хлорфасинон). Все они относятся к ядам кумулятивного действия. Кроме того, в последние годы разрешен к применению яд острого действия — цинка фосфид.

Все родентициды относятся к первому классу опасности и могут быть причиной отравлений сельскохозяйственных животных, в том числе птиц.

Родентициды из группы антикоагулянтов имеют сравнительно низкую токсичность для птиц. Наиболее часто отравления пестицидами этой группы регистрируются среди свиней в результате поедания небрежно разложенных отравленных приманок. Цинка фосфид высокотоксичен для млекопитающих и птиц, поэтому отравления этим родентицидом регистрируют у сельскохозяйственных и диких животных всех групп.

Определение зоокумарина в кормах, тканях животных и отравленных приманках (по М. Ф. Болоховец, В. В. Ермакову, 1987).

Зоокумарин — белое кристаллическое вещество, почти нерастворимое в воде и бензоле, растворимое в ацетоне и диоксане. ЛД5о для крыс 4—8 мг/кг, для свиней — 10 мг/кг. Малотоксичен для кур. Выпускают в виде порошка с концентрацией действующего вещества 0,5—1 % с наполнителем, в качестве которого используют крахмал или тальк. Применяют для уничтожения серых крыс и домовых мышей в населенных пунктах, животноводческих помещениях, складах в виде отравленных приманок 5%-ной концентрации по препарату. Отмечены случаи отравления свиней. Кумариноподобные соединения содержат некоторые растения и образуют микроскопические грибы (плесени). Поэтому необходимо ставить дифференциальный диагноз на отравление.

Принцип. Хроматографические методы основаны на извлечении зоокумарина из кормов и биологического материала органическим растворителем, очистке экстрактов на колонке с алюминия оксидом и последующем определении зооцида в закрепленном слое силикагеля по реакции диазосочетания или в виде метилового эфира на газовом хроматографе с детектором электронного захвата.

Спектрофотометрический метод основан на извлечении зооцида из отравленных приманок, кормов или тканей животных хлороформом с последующей очисткой на колонке с алюминия оксидом и определении натриевой соли зоокумарина по характерному поглощению света в УФ-области спектра при 308 нм.

Метрологические характеристики методов: нижний предел определения методом ТСХ — 2 мкг, или 0,2 мг/кг зоокумарина в пробе, методом ГЖХ — 1 нг, или 0,02 мг/кг, степень определения — 80 %; спектрофотометрическим методом — 10 мг/кг корма, 0,4 мг/кг мышечной ткани и крови животных.

Реактивы: аммиак водный 25%-ный (ч. д. а.);

ацетон абсолютный. 0,5 л ацетона встряхивают 30 мин с 50 г безводного кальция хлорида, а затем перегоняют на кипящей водяной бане; первые и последние 50 мл дистиллята отбрасывают, а остальное количество собирают в склянку с притертой пробкой. Хранят без доступа воздуха;

диметилсульфат;

  1. дихлоранилин, насыщенный раствор в 0,33 М соляной кислоты. 1 г вещества смешивают со 100 мл 0,33 М кислоты хлористоводородной и встряхивают 1 ч. Хранят в склянке из темного стекла в холодильнике до 3 мес;

зоокумарин, основной раствор — 1 мг/л.

100 мг зооцида растворяют в 100 мл ацетона;

зоокумарина стандартный раствор для УФ-спектрофотометрии, 0,1 мг/мл. 10 мг зооцида растворяют в 2%-ном растворе натрия гидроксида в мерной колбе на 100 мл;

кальция хлорид безводный (ч. д. а.);

калия карбонат (ч. д. а.)- Соль растирают в порошок, прокаливают 6 ч при 160 °С и хранят в эксикаторе над безводным кальция хлоридом;

натрия нитрит (х. ч.), 1%-ный водный раствор свежеприготовленный;

реагент метилирующий. В колбу на 100 мл вносят 5 г безводного калия карбоната, 47,5 мл абсолютного ацетона и 2,5 мл диметил- сульфата. Готовят в день употребления;

проявляющий реактив. Смешивают 2,5 мл 1 %-ного водного раствора натрия нитрита с 25 мл насыщенного раствора 2,4-дихлора- нилина в 0,33 М кислоте хлористоводородной. Готовят 1 раз в неделю;

подвижный растворитель гексан-ацетон 2:1 (по объему).

Оборудование: аналитические весы, шуттель-аппарат; хроматографические камеры; эксикатор; спектрофотометр СФ-4а или другой аналогичный прибор для измерения поглощения в УФ-об- ласти спектра; колбы Эрленмейера на 50, 100 и 250 мл; чашки для выпаривания № 5 и 10; мерные цилиндры на 50 и 100 мл; мерные колбы на 100 мл; пипетки на 1, 2, 5 и 10 мл; микропипетки на 0,1 мл; воронки для фильтрования № 3 и 5; пластинки стеклянные размером 9 х 12 см; пробирки длиной 15 см, диаметром 1,5 см, градуированные на 15 мл; колонки стеклянные для хроматографии длиной 35 см, с внутренним диаметром 1,5 см. В качестве колонки можно использовать нижнюю часть бюретки на 100 мл, разрезав ее пополам; газовый хроматограф серии «Цвет-500», ЛХМ-2000 или аналогичный прибор с детектором электронного захвата; колонка насадочная для газовой хроматографии стеклянная длиной 0,75 м, диаметром 3 мм с фазой 5 % 8Е-30 на силанизированном хрома- тоне 80—100 меш; микрошприцы на 10 мкл; баня водяная; мельница шаровая; ступка фарфоровая; готовые к употреблению пластинки для ТСХ типа «Силуфол», «Плазмохром», «Армсорб».

Ход определения. Для постановки диагноза на отравление зоокумарином исследуют пробы мышечной ткани, печени и почек. Навеску пробы массой 25 г гомогенизируют, помещают в колбу Эрленмейера на 250 мл. В эту же колбу вносят 10 мл 1 н. серной кислоты. Содержимое перемешивают, добавляют 75 мл хлороформа и встряхивают на шуттель-аппарате 40 мин. Затем в колбу вносят через фильтровальную воронку небольшими порциями (чтобы избежать образования комков) 65 г натрия сульфата. Отделившийся хлороформный экстракт фильтруют в колбу на 200 мл через тампон стекловаты (или обычной ваты). Извлечение зоокумарина повторяют еще раз 50 мл хлороформа, повторяя встряхивание кол

бы в течение 15 мин. Экстракт фильтруют через ватный тампон в колбу на 200 мл.

Объединенный экстракт пропускают через колонку, которую готовят следующим образом. В нижнюю часть колонки помещают слой ваты (1 см), вносят 10 г алюминия оксида, промывают 20 мл хлороформа и заливают очищенный экстракт. После того как весь экстракт опустится до адсорбента, колонку промывают 100 мл хлороформа, а затем 20 мл ацетона. Зоокумарин элюируют с колонки 50 мл смеси ацетона и 2%-ного раствора натрия гидроксида (47:3). Элюат собирают в фарфоровую чашку № 10, добавляют 0,2 мл ледяной уксусной кислоты и упаривают досуха на кипящей водяной бане. Для определения зоокумарина на спектрофотометре уксусную кислоту не добавляют.

Определение зоокумарина с помощью ТСХ.

Сухой остаток после выпаривания растворяют в 0,5 мл ацетона и полностью наносят в одну точку с помощью микропипетки или пипетки Пастера на старт хроматографической пластинки. Одновременно готовят стандарты, внося в фарфоровую чашку 5—10 мкг вещества, что соответствует 0,5—1,0 мл рабочего раствора зоокумарина. Образцы наносят на пластинки в следующей последовательности: стандарт (5 мкг), образец (1-я повторность), образец (2-я повторность), стандарт (10 мкг). Размер пятна не должен превышать 0,5 см2. Места нанесения проб располагают на расстоянии 1,0—2,0 см друг от друга и от нижнего и боковых краев пластинки; пятна не должны погружаться в растворитель.

В камеру для хроматографирования наливают 60 мл смеси гексана и ацетона (2:1) и через 20 мин помещают в нее пластинку в вертикальном положении. Камеру герметично закрывают. Хроматографирование проводят при температуре не ниже 20 °С. После того как растворитель поднимется на высоту 8—9 см, пластинку вынимают, отмечают фронт растворителя и помещают в сушильный шкаф при 105 °С на 3 мин. Затем пластинку охлаждают и опрыскивают из пульверизатора проявляющим реагентом, вновь высушивают при тех же условиях и помещают в эксикатор над парами аммиака на 1 мин. Зоокумарин проявляется в виде коричневых пятен на желтом фоне с Ш- 0,4—0,5 в тонком слое силикагеля и М 0,29—0,35 на «Силуфоле». Количество пестицида в пробе определяют сравнением интенсивности окраски и площади пятна стандарта и образца. В случае если содержание зооцида в пробе превышает 10 мкг, следует получить хроматограмму стандартов ббльшей концентрации (20—100 мкг).

Расчет. Содержание зоокумарина в исследуемой пробе (х, мг/кг) вычисляют по формуле

Определение зоокумарина с помощью ГЖХ. Полученный после выпаривания остаток растворяют в 3 мл метилирующего реагента и переносят в пробирку длиной 15 см, диаметром 1,5 см, содержащую 500 мг безводного калия карбоната. Пробирку закрывают ватным тампоном и выдерживают в водяной бане при 65 °С в течение 15 мин. Затем содержимое переносят в делительную воронку на 100 мл посредством 30 мл дистиллированной воды и 5 мл гексана. Метиловый эфир зоокумарина экстрагируют путем встряхивания делительной воронки в течение 2 мин. Водную фазу отбрасывают, экстракт промывают 15 мл насыщенного раствора натрия хлорида и сливают в сухую пробирку.

В испаритель газового хроматографа вводят 5 мкл экстракта и проводят хроматографирование при следующих условиях: расход газа-носителя 80 мл/мин, поддув 120 мл/мин; температура термостата детектора, колонки и испарителя 250, 225 и 250 °С соответственно; чувствительность электрометра 1 • 10 А; скорость протяжки ленты самописца 1 см/мин; время удерживания метилового эфира зоокумарина 2,5 мин; высота пика при введении в испаритель 10 нг вещества 80 мм; линейный диапазон от 5 до 25 нг.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки по градуировочному графику, по высоте пика. График строят в интервале концентраций от 5 до 25 нг зоокумарина. С этой целью в фарфоровые чашки вносят 5, 10 и 20 нг зоокумарина в ацетоне. Ацетон выпаривают, а остаток метилируют, как и пробы. Введение в испаритель хроматографа 5 мкл гексанового экстракта соответствует детектированию 5, 10 и 20 нг зооцида.

Расчет. Содержание зоокумарина в анализируемой пробе (х, мг/кг) находят по формуле

где Ск — количество вещества, найденное по градуировочному графику, нг; У\ — объем экстракта, мл; У2 — объем экстракта, вводимого в газовый хроматограф, мкл; Р — масса анализируемой пробы, г.

Спектрофотометрическое определение зоокумарина в мышечной ткани животных. Полученный после выпаривания экстракта остаток в фарфоровой чашке растворяют в 4 мл 2%-ного раствора натрия гидроксида, фильтруют через бумажный фильтр в пробирку и измеряют оптическую плотность при 308 нм. Для сравнения используют пробу мышечной ткани здорового животного того же вида.

 

  Расчет

 

  Расчет

  . Концентрацию зоокумарина в образце (х, мг/кг) вычисляют по формуле

Клиническое значение. Предварительный лабораторный диагноз на отравление зоокумарином может быть поставлен при обнаружении в мышечной ткани остатков зооцида в количестве 5—10 мг/кг. Окончательный диагноз ставят по результатам сопоставления данных лабораторного исследования с клиническими признаками интоксикации (кровянистые истечения из носа и анального отверстия, образование подкожных гематом, понижение свертываемости крови), а также по характерным патологоанатомическим изменениям (множественные кровоизлияния во внутренние органы, гематомы в подкожной клетчатке, карпальных и тарзальных суставах).

 

<< | >>
Источник:   И. П. Кондрахин.   Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник — М.: Колос,. — 520 с.. 2004

Еще по теме   МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РОДЕНТИЦИДОВ (ЗООКУМАРИНА, БРОМАДИОЛОНА, БРОДИФАКУМА, ЦИНКА ФОСФИДА)  :

  1.   Определение цинка фосфида в патологическом материале  
  2. Качественное обнаружение фосфида цинка (по фосфору)
  3.   Определение цинка в крови с дитизоном по Н. А. Чеботаревой. 
  4.   Определение активности а-амилазы в сыворотке крови, моче, дуоденальном содержимом амилоклассическим методом со стойким крахмальным субстратом (метод Каравея).  
  5.   МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ  
  6.   МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНОВ  
  7.   МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНОВ  
  8.   МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПИРЕТРОИДОВ  
  9.   Определение ФОП методами ГЖХ.  
  10.   МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛКАЛОИДОВ  
  11.   МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИАНИДОВ  
  12.   МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕРБИЦИДОВ ГРУППЫ 2,4-Д  
  13.   Ионометрический метод определения нитратного  
  14. Разработка метода, определения остаточных количеств препаратов.