<<
>>

  Определение активности а-амилазы в сыворотке крови, моче, дуоденальном содержимом амилоклассическим методом со стойким крахмальным субстратом (метод Каравея).  

  Принцип, а-амилаза гидролизует расщепление крахмала с образованием конечных продуктов, не дающих цветной реакции с йодом. Об активности а-амилазы судят по уменьшению интенсивности окраски концентрации крахмала.
Реактивы: бензойная кислота (ч.
д. а. или х. ч.);
натрия фосфат двузамещенный безводный (NaHPO^ ч. д. а.);
крахмал растворимый для нефелометрии или крахмал по Lintner. Крахмал по Lintner выпускают зарубежные фирмы специально для использования в качестве субстрата при определении а-амилазы;
154 ммоль/л раствор натрия хлорида;
субстратно-буферный раствор pH 7. 13,3 г безводного двузаме- щенного натрия фосфата и 2,0 г бензойной кислоты растворяют в 250 мл 154 ммоль/л раствора натрия хлорида и доводят до кипения. Суспендируют 0,2 г растворимого крахмала (крахмал для колориметрии) в небольшом количестве холодной воды и вводят в кипящий буферный раствор. Кипятят 1 мин, охлаждают и доводят объем дистиллированной водой до 500 мл. Стабилен при комнатной температуре в течение 10—12 дней. Субстратно-буферный раствор должен быть прозрачным;
калия йодид (ч. д. а. или х. ч.);
калия фторид (ч. д. а.);
калий йодноватокислый (ч. д. а., х. ч.);
кислота хлористоводородная (НС1) концентрированная (х. ч.);
0,01 н. раствор йода. 0,036 г калия йодноватокислого и 0,45 г калия йодида растворяют в 40 мл воды и медленно при помешивании добавляют 0,09 мл концентрированной НС1. 5 г калия фторида растворяют в 50 мл воды, фильтруют в мерную колбу, приливают 40 мл раствора йода и доливают водой до 100 мл. Хранят в посуде из темного стекла. Годен в течение 1 мес. Если в рабочий раствор йода не добавляют калия фторид, то его необходимо готовить ежедневно.
Оборудование: фотоэлектроколориметр; термостат; пробирки, пипетки; мерные колбы; секундомер.
Материал для исследования: светлая сыворотка или плазма крови; моча; дуоденальное содержимое, предварительно разбавленное 154 ммоль/л раствором натрия хлорида.
Ход определения. 5 мл субстратно-буферного раствора вносят в колбу на 50 мл, нагревают 5 мин при 37 °С, добавляют 0,1 мл сыворотки, профильтрованной мочи или дуоденального содержимого (предварительно разведенного 154 ммоль/л раствором натрия хлорида в 100 раз). Инкубируют 7,5 мин при 37 °С. Время инкубации следует строго отсчитывать по секундомеру с момента добавления биологической жидкости в крахмальный субстрат. Тотчас же после инкубации добавляют 5 мл 0,1 н. раствора йода и доводят объем дистиллированной водой до 50 мл. Измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 630—690 нм (красный светофильтр) против воды.
Холостую пробу ставят так же, как опытную, но биологическую жидкость добавляют после инкубации вместе с 0,1 н. раствором йода. Измеряют при тех же условиях, что и опытную пробу, против воды.
Расчет активности а-амилазы выражают в мг или г крахмала, гидролизованного 1 л биологической жидкости за 1 с инкубации при 37 °С.
Расчет ведут по формулам
х=ёфакш»
Е\
х = Е11Е1 ¦ 160 • К,
Е\
где х — активность а-амилазы, мг/с • л; Е\ — экстинкция холостой пробы; — экстинкция опытной пробы; С — количество крахмала, введенного в опытную и холостую пробы (2 мг); / (160) — коэффициент пересчета на 1 с инкубации; К — коэффициент пересчета на 1 л биологической жидкости с учетом разведения.
Источник: 43.
Клиническое значение. Фермент амилаза (диастаза) осуществляет гидролитическое расщепление полисахаридов до декстринов и мальтозы. Богаты амилазой сок поджелудочной железы и слюна. В кровь фермент поступает главным образом из поджелудочной железы, поэтому активность амилазы в крови и моче повышается обычно при заболевании поджелудочной железы. При остром панкреатите она повышается в 10 раз и более. Кроме того, амилазная активность возрастает при перитоните, язвенной болезни свиней, собак и других животных, при заболеваниях почек. Повышение активности амилазы крови, как правило, сопровождается адекватным увеличением ее активности в моче. Однако при нефрозах, гломерулонефритах активность амилазы сыворотки крови увеличена, а в моче снижена.
Снижение активности амилазы в крови и моче наблюдается при гепатитах, дистрофиях печени, сахарном диабете, гипотиреозе, токсической диспепсии.
Нормативы активности а-амилазы в сыворотке крови, моче и других биологических субстратах целесообразно находить на здоровых животных-аналогах.
Примечание: Для получения плазмы крови используют только гепарин. Амилаза стабильна в сыворотке и плазме в течение 1 нед при комнатной температуре или при 2—8 °С, при минус 20 °С — 1 год.
 
<< | >>
Источник:   И. П. Кондрахин.   Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник — М.: Колос,. — 520 с.. 2004

Еще по теме   Определение активности а-амилазы в сыворотке крови, моче, дуоденальном содержимом амилоклассическим методом со стойким крахмальным субстратом (метод Каравея).  :

  1.   Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови по гидролизу р-глицерофосфата (метод Бодански).  
  2.   Определение активности сорбитолдещдрогеназы (СДГ) в сыворотке крови по реакции с резорцином (метод Севела—Товарека). 
  3.   Определение активности креатинкииазы (КК) в сыворотке (плазме) крови с использованием креатинфосфата в качестве субстрата. 
  4.   Определение общего белка в сыворотке крови рефрактометрическим методом.  
  5.   Определение свободного аминного азота в сыворотке крови по методу Г. А. Узбекова в модификации 3. С. Чулковой.  
  6.   Определение белковых фракций в сыворотке крови турбидимет- рическим (нефелометрическим) методом.  
  7.   Определение токоферолов в тканях и сыворотке крови методом колоночной хроматографии. 
  8.   Определение билирубина в сыворотке крови животных по методу Ендрассика—Клеггорна—Грофа в модификации В. И. Левченко и В. В. Влизло. 
  9.   Определение билирубина в сыворотке крови по диазореакции (метод Ендрассика—Клеггорна—Грофа).  
  10.   Определение активности у-глутамилтранспептидазы (у-глута- милтрансферазы) в сыворотке крови с помощью набора реактивов.  
  11.   Определение активности холинэстеразы в сыворотке крови по гидролизу ацетилхолинхлорида. 
  12.   Определение активности а-амилазы.  
  13.   Экспресс-метод обнаружения ацетоновых тел в сыворотке (плазме) крови. 
  14.   Определение витамина Е в сыворотке крови (см. с. 195). Определение церулоплазмина в сыворотке крови.  
  15.   ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ МИКРОФЛОРЫ РУБЦА  
  16.   Определение марганца в крови перйодатным методом.  
  17.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЗЕРВНОЙ ЩЕЛОЧНОСТИ КРОВИ ДИФФУЗНЫМ МЕТОДОМ ПО И. П. КОНДРАХИНУ  
  18.   Метод неферментативного определения лактата и пирувата в одной пробе крови.