<<
>>

  Определение активности у-глутамилтранспептидазы (у-глута- милтрансферазы) в сыворотке крови с помощью набора реактивов.  

  Принцип. у-Глутамилтранспептидаза (ГГТ) катализирует реакцию переноса Ь-глутаминового остатка с хромогенного субстрата на глицилглицин. При этом высвобождается я-нитроанилин, оптическую плотность которого измеряют фотометрически.
Активность фермента определяют по приращению оптической плотности раствора кинетическим методом или методом постоянного времени. Активность фермента наиболее высока в почках, поджелудочной железе, печени и предстательной железе.

Реактивы: субстрат 200 мг Ь-глутамил-л-нитроанилина;

    1. г буферной смеси (глицилглицин 1,26 г, трис 1,21 г);
  1. мл стандартного 5 моль/л раствора я-нитроанилина;

дополнительный реактив — 10%-ная уксусная кислота.

Оборудование: фотоэлектроколориметр или спектрофок метр, длина волны 400—430 нм.

Приготовление рабочих растворов. 1. Буферный раствор, pH 8,1.

  1. г буферной смеси растворяют в 70—80 мл дистиллированной воды в мерной колбе на 100 мл и доливают водой до метки. Раствор стабилен при хранении в холодильнике. 2. Субстратно-буферный раствор. Отбирают 40 мг субстрата и растворяют в 18 мл дистиллированной воды, добавляют 17 мл буферного раствора и доводят до температуры 37 °С. Раствор устойчив при 15—25 °С в течение 10 ч.

Ход определения. Кинетический метод. В кювету длиной

  1. см, термостатированную при 37 °С, помещают 1,2 мл субстратно-буферного раствора, предварительно приведенного к 37 °С. Затем вводят 0,1 мл сыворотки или плазмы крови, перемешивают и начинают отсчет времени. Измеряют оптическую плотность раствора при 400—430 нм (Н§ 405 нм) против воды в течение 1—5 мин после старта.

Для калибровочной пробы 0,1 мл стандартного раствора «-нитроанилина (содержимое ампулы) доводят дистиллированной водой до 5 мл.

Измеряют оптическую плотность раствора в условиях, аналогичных опытной пробе.

Расчет активности у-глутамилтранспептидазы ведут по формулам

х = 21660^ или А

х = 77,98 Ц,

А

где х — активность фермента, нмоль/с-л или мкмоль/ч-мл; 21660 — коэффициент для перевода в нмоль/с • л; 77,98 — коэффициент для перевода в мкмоль/ч - л; VА — разность экстинкций опытной пробы в пересчете на 1 мин инкубации; А — экстинкция калибровочной пробы.

Метод постоянного времени. В пробирку вносят 1 мл субстратно-буферного раствора, приведенного к температуре 37 °С, и приливают 0,1 мл сыворотки или плазмы крови. Содержимое перемешивают и инкубируют точно 15 мин при 37 °С. Затем добавляют

  1. мл 10%-ного раствора уксусной кислоты и перемешивают.

Холостую пробу ставят так же, как и опытную, но сыворотку добавляют после инкубации.

Измеряют экстинкцию опытной пробы против холостой при длине волны 400—430 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

Активность у-глутамилтранспептидазы определяют по калибровочному графику. Для построения его из стандартного раствора л-нитроанилина (содержимое ампулы) готовят разведения в соответствии с таблицей 37.

пробирки

Стандартный раствор л-нигроанили- на, мл

Дистиллированная вода, мл

Активность фермента

нмоль/с • л

мкмоль/ч • мл

1

0,1

0,9

550

1,98

2

0,2

0,8

1100

3,96

3

0,4

0,6

2200

7,92

4

0,8

0,2

4400

15,84

5

1,0

5500

19,80

В пробирке отмеривают по 0,1 мл полученных растворов, добавляют по 7 мл 10%-ного раствора уксусной кислоты, перемешивают и фотометрируют против воды в условиях, аналогичных опытной пробе. Строят график зависимости оптической плотности раствора от активности фермента.

Линейность калибровочного графика сохраняется до активности 5000 нмоль/с • л.

Клиническое значение.

Активность фермента в сыворотке крови повышается при гепатобилиарных заболеваниях, болезнях поджелудочной железы, диабете. Наиболее высокая активность ГГТ (ГГФ) отмечается при закупорке желчных протоков и других холестических состояниях, а также при вовлечении печени в злокачественный процесс, когда без признаков желтухи активность фермента возрастает в 10—15 раз. При хроническом гепатите активность ГГФ повышается в несколько раз. ГГФ особенно чувствительна к гепатотоксическим воздействиям. Определение активности ГГТ (ГГФ) — наиболее чувствительный скрининговый тест на заболевание печени, который предпочтительнее определения трансамиаз или щелочной фосфатазы.

По данным Н. В. Утеченко (2003), активность ГГТ в сыворотке крови телят при токсической гепатодистрофии составляла 1103,0 (±118,4) — 2393,0 (±417) нкат/л при норме 150,0 (±30,0) нкат/л.

Примечания. 1. Методика утверждена Минздравом Украины.

Приказ № 91 от 8.04.1998 г. 2. При активности пробы выше 5000 нмоль/с • л ее разбавляют физиологическим раствором (0,9 % натрия хлорида). Результат умножают на разделение. 3. Активность у-глутамилтранспептидазы не изменяется в течение 7 дней при хранении сыворотки крови при 4 °С и в течение 3 мес при минус 20 °С. 4. В случае использования кюветы с рабочим объемом более 1 мл количество рабочего раствора необходимо пропорционально увеличить. 5. Из всех антикоагулянтов предпочтение отдается ЭДТА. Калия окса- лат с натрия фторидом снижают активность ГГТ.

  1. В сыворотке крови активность ГГТ выше, чем в плазме. 7. Билирубинемия, гемоглобин, липемия дают ложнозаниженные результаты.

В связи с неравномерным внесением в почву больших доз азотных удобрений возникает возможность накопления в кормах и воде высоких концентраций нитратного и нитритного азота. При поедании таких кормов или использовании воды у животных нарушается обмен веществ, репродуктивная функция и даже возможно отравление.

В системе профилактики нитратного и нитритного токсикоза важное значение имеет систематический контроль за концентрацией нитратов и нитритов в кормах, воде, крови, молоке и других субстратах.

Для определения нитратного и нитритного азота в почве, кормах, воде и биологических субстратах используют фотометрические, ионометрические и другие методы, применяют автоанализаторы проточного типа.

В ветеринарных и зоотехнических лабораториях для определения нитратов и нитритов в кормах, крови и патологическом материале чаще применяют колориметрический метод с использованием реактива Грисса. В последнее время в агрономии, зоотехнике и ветеринарии широко используют ионометрический экспресс-метод определения нитратного азота в почвах, растениях, кормах, природных водах и биологических субстратах.

 

<< | >>
Источник:   И. П. Кондрахин.   Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник — М.: Колос,. — 520 с.. 2004

Еще по теме   Определение активности у-глутамилтранспептидазы (у-глута- милтрансферазы) в сыворотке крови с помощью набора реактивов.  :

  1.   Определение мочевой кислоты в сыворотке крови животных с использованием заводского набора реактивов.  
  2.   Определение мочевой кислоты в сыворотке крови по реакции с фосфорно-вольфрамовым реактивом. 
  3.   Определение неорганического фосфора в сыворотке крови с ва- надат-молибденовым реактивом (по Пулсу в модификации В. Ф. Коромыслова и Л. А. Кудрявцевой).  
  4.   Определение активности холинэстеразы в сыворотке крови по гидролизу ацетилхолинхлорида. 
  5.   Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови по гидролизу р-глицерофосфата (метод Бодански).  
  6.   Определение активности креатинкииазы (КК) в сыворотке (плазме) крови с использованием креатинфосфата в качестве субстрата. 
  7.   Определение активности сорбитолдещдрогеназы (СДГ) в сыворотке крови по реакции с резорцином (метод Севела—Товарека). 
  8.   Определение витамина Е в сыворотке крови (см. с. 195). Определение церулоплазмина в сыворотке крови.  
  9.   Определение активности а-амилазы в сыворотке крови, моче, дуоденальном содержимом амилоклассическим методом со стойким крахмальным субстратом (метод Каравея).  
  10.     Определение нитритов в кормах, крови и патологическом материале с использованием реактива Грисса.  
  11.   Определение нитратов в кормах, крови, молоке и патологическом материале с использованием реактива Грисса.  
  12.   Определение белковых фракций в сыворотке крови. 
  13.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕСТОСТЕРОНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DIAGNOSTICAUTOMATIONINC., США)  
  14.   Определение сиаловых кислот в сыворотке крови по реакции с резорцином. 
  15.   Определение белковых фракций в сыворотке крови турбидимет- рическим (нефелометрическим) методом.