<<
>>

  Определение активности холинэстеразы в сыворотке крови по гидролизу ацетилхолинхлорида. 

  Принцип. Под действием холинэстеразы происходит гидролиз ацетилхолинхлорида с образованием уксусной кислоты и холина. Уксусная кислота сдвигает pH буферного раствора, что устанавливается с помощью индикатора по изменению цвета буферного раствора.

Реактивы: 0,9 моль/л раствор ацетилхолинхлорида.

1,63 г ацетилхолинхлорида растворяют в 10 мл дистиллированной воды. При использовании фармакопейного ампулированного препарата содержимое одной ампулы (0,2 г) растворяют в 1,2 мл воды. Раствор хранят в холодильнике. Годен в течение 6—7 дней (из-за гигроскопичности открытую склянку с ацетилхолинхлоридом хранят в эксикаторе);

вероналовый буфер, pH 8,4. 1,5450 г натриевой соли веронала (мединала) растворяют в 500 мл дистиллированной воды, добавляют 9 мл 0,1 моль/л раствора соляной кислоты и 150 мл 0,1 г/л раствора индикатора, измеряют pH. Объем доводят дистиллированной водой до 1 л. Буфер хранят в холодильнике в посуде из темного стекла. Годен в течение 1 мес;

индикатор — фиолетовый синий с переходом окраски от желтой к красной в пределах pH 6,8—8,4. 0,1 г сухого индикатора растирают в ступке с 5,7 мл 0,05 моль/л раствора натрия гидроксида. После растворения объем доводят дистиллированной водой до

  1. мл. Из полученного 0,4%-ного раствора перед употреблением готовят 0,01 %-ный раствор разведением его дистиллированной водой в 40 раз;

0,7%-ный водный раствор прозерина. 0,7 г прозерина растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Хранят в посуде из темного стекла;

0,1 моль/л раствор уксусной кислоты. Готовят из стандарт-титра (фиксанала) или путем доведения дистиллированной водой 5,7 мл ледяной уксусной кислоты (х. ч.) до 1000 мл в мерной колбе на 1 л.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; водяная баня; ультратермостат; мерные колбы.

Ход определения.

В пробирку вносят 5 мл вероналового буфера, 0,2 мл дистиллированной воды и 0,1 мл сыворотки. Смесь прогревают при температуре 37 °С в течение 5 мин. Затем добавляют 0,2 мл раствора ацетилхолинхлорида и инкубируют в течение 30 мин при температуре 37 °С. После инкубации добавляют 0,2 мл раствора прозерина. Экстинкцию измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 5 мм при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) против воды. Окраска устойчива в течение 1 ч.

Контроль ставят так же, как опыт, но раствор прозерина добавляют до инкубации.

Из экстинкции контрольной (холостой) пробы вычитают экстинкцию опытной. Расчет ведут по калибровочному графику. Активность холинэстеразы выражают в микромолях уксусной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 ч инкубации или в нмоль/с • л. В этом случае полученную величину умножают на коэффициент 0,280.

Для построения калибровочного графика из 0,1 моль/л раствора уксусной кислоты готовят разведения, как указано в таблице 35.

Из каждого разведенного раствора отбирают по 0,2 мл, добавляют 5 мл вероналового буфера и 0,1 мл сыворотки, прогревают

  1. мин при температуре 37 °С, добавляют 0,2 мл раствора прозерина, 0,2 мл ацетилхолинхлорида. Смесь инкубируют 30 мин при температуре 37 °С, быстро охлаждают. Экстинкцию измеряют при тех же условиях, что и в опытных пробах. Холостую пробу ставят
  2. 35. Разведения раствора уксусной кислоты для построения калибровочного графика


про

бирки

0,1 моль/л раствор уксусной кислоты, мл

Дистиллированная вода, мл

Содержание уксусной кислоты в калибровочной пробе, мкмоль

Активность холинэстеразы, мкмоль/с • л

1

2

8

4

22,2

2

4

6

8

44,5

3

6

4

12

66,7

4

8

2

16

89,0

5

9

1

18

100,0

так же, как калибровочную, но вместо стандартных растворов используют дистиллированную воду.

Из экстинкции холостой пробы вычитают экстинкцию калибровочной пробы. Полученную величину экстинкции откладывают на оси ординат, количество мкмоль уксусной кислоты — на оси абсцисс. Линейная зависимость калибровочного графика сохраняется в пределах от 0 до 110 мкмоль/с • л.

Примечания. 1. Активность холинэстеразы заметно не изменяется при хранении сыворотки в герметически закрытых пробирках в холодильнике при температуре 2—6 °С в течение 4 дней. 2. Исследование должно проводиться тотчас после доставки образцов крови в лабораторию. 3. Ложноотрицательные результаты вследствие ингибирования активности холинэстеразы дают цитраты (антикоагулянты), оксалаты, фториды. 4. Определение активности холинэстеразы в сыворотке крови возможно методом с субстратом бутирилтиохолина йодидом.

Источники: 19, 43.

Клиническое значение. Холинэстераза расщепляет аце- тилхолин на холин и уксусную кислоту. Фермент синтезируется в печени, поэтому степень активности холинэстеразы во многом зависит от функционального состояния этого органа.

У здоровых животных активность холинэстеразы сыворотки крови ориентировочно составляет 150—300 мкмоль/ч ¦ мл (42—84 нмоль/с ¦ л). Уменьшение активности холинэстеразы отмечается при хроническом гепатите, циррозе печени, отравлениях фосфорорганическими средствами. Активность холинэстеразы низка у новорожденных животных.

Определение активности уреазы в сое. Реактивы: индикатор феноловый красный. В 10 мл этилового спирта растворяют 50 мг индикатора;

калия фосфат двузамещенный (К2НРО4) и калия фосфат одноза- мещенный (КН2РО4) (ч. д. а., х. ч.) перекристаллизованные;

0,05 н. раствор К2НРО4. 8,7 г вещества растворяют дистиллированной водой в мерной колбе на 1 л;

0,05 н. раствор КН2РО4. 6,8 г вещества растворяют дистиллированной водой в мерной колбе на 1 л;

мочевина (карбамид);

эталонные буферные растворы готовят в колбочках с притертыми пробками, как указано в таблице 36.

Оборудование: ступка фарфоровая; сито с отверстиями диаметром 0,25 мм; колбочки с притертыми пробками.

Ход определения. Измельчают соевый шрот или зерно сои, просеивают на сите. В каждую из семи пробирок вносят по 10 мл эталонного буферного раствора с соответствующими pH и по 2 капли раствора индикатора. В две параллельные пробирки

N° колбочки

Вносимые компоненты

pH раствора

раствор № 3, мл

раствор № 4, мл

1

61,1

38,9

7,00

2

66,6

33,4

7,10

3

72,0

28,0

7,20

4

80,8

19,2

7,40

5

87,0

13,0

7,60

б

91,5

8,5

7,80

7

94,7

5,3

8,00

вносят по 0,2 г измельченного соевого шрота или соевой муки, по 10 мл буферного раствора № 1 (pH 7,00), по 0,3 г мочевины и по

  1. капли раствора индикатора. Пробирки со смесью выдерживают в водяной бане при температуре 20—25 °С в течение 30 мин, периодически осторожно встряхивают. Появившуюся в пробирках окраску сравнивают с эталонной в семи буферных растворах, находят pH испытуемой пробы.

Активность уреазы определяют по формуле

х = pH, - рН0gt;

где х — активность уреазы, pH; pH, — величина pH раствора испытуемого образца; рН0 — pH исходного буферного раствора (pH 7,00).

В параллельных пробах корма допускаются расхождения pH не более ±0,05.

Клиническое значение. В соевых кормах, не подвергшихся соответствующей термической обработке, имеются ингибиторы трипсина. Поедание таких кормов птицей и свиньями вызывает расстройство пищеварения, диарею и другие нежелательные последствия. Поэтому в таких кормах перед их скармливанием определяют активность уреазы и выражают ее величиной pH. В соевой муке и шроте для птиц pH должен быть не более 0,1.

 

<< | >>
Источник:   И. П. Кондрахин.   Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник — М.: Колос,. — 520 с.. 2004

Еще по теме   Определение активности холинэстеразы в сыворотке крови по гидролизу ацетилхолинхлорида. :

  1.   Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови по гидролизу р-глицерофосфата (метод Бодански).  
  2.   Определение активности у-глутамилтранспептидазы (у-глута- милтрансферазы) в сыворотке крови с помощью набора реактивов.  
  3.   Определение активности креатинкииазы (КК) в сыворотке (плазме) крови с использованием креатинфосфата в качестве субстрата. 
  4.   Определение активности сорбитолдещдрогеназы (СДГ) в сыворотке крови по реакции с резорцином (метод Севела—Товарека). 
  5.   Определение витамина Е в сыворотке крови (см. с. 195). Определение церулоплазмина в сыворотке крови.  
  6.   Определение активности а-амилазы в сыворотке крови, моче, дуоденальном содержимом амилоклассическим методом со стойким крахмальным субстратом (метод Каравея).  
  7.   Определение белковых фракций в сыворотке крови. 
  8.   Определение сиаловых кислот в сыворотке крови по реакции с резорцином. 
  9.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕСТОСТЕРОНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DIAGNOSTICAUTOMATIONINC., США)  
  10.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНСУЛИНА В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (DIAGNOSTICSYSTEMLABORATORY, США)  
  11.   Определение общего белка в сыворотке крови рефрактометрическим методом.  
  12.   Определение белковых фракций в сыворотке крови турбидимет- рическим (нефелометрическим) методом.  
  13.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОРТИЗОЛА В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (DIAGNOSTICSYSTEMLABORATORY, США)  
  14.   Определение активности пероксидазы (КФ 1.11.1.7) в крови. 
  15.   Определение общего кальция в сыворотке крови комплексоном Арсеназо III.  
  16.   Определение содержания Р-липопротеидов в сыворотке (плазме) крови (по Бурштейну в модификации Виноградовой).  
  17.   Определение мочевины в сыворотке крови по цветной реакции с диацетилмонооксимом.  
  18.   Определение свободного аминного азота в сыворотке крови по методу Г. А. Узбекова в модификации 3. С. Чулковой.  
  19.   Определение каротина в сыворотке (плазме) крови по Карп н Прейсу в модификации Юдкина.