<<
>>

  Определение белковых фракций в сыворотке крови. 

  Для определения белковых фракций в сыворотке крови используют методы фотометрии, высаливания нейтральными солями, электрофоретического фракционирования, иммунологические и др.
Из электрофоретических методов предпочтение отдается электрофорезу на пленках из ацетата целлюлозы и электрофорезу на бумаге.
Однако для выполнения этих методов требуются дефицитные реактивы и специальные приспособления и приборы, поэтому широкого применения в ветеринарии они не находят. Наиболее простые методы приведены ниже.
Определение альбумина в сыворотке крови по реакции с бром- крезоловым зеленым. Принцип. При взаимодействии альбумина с бромкрезоловым зеленым в слабокислой среде в присутствии детергента образуется окрашенный комплекс синего цвета.
Реактивы: уксусная кислота, 1 моль/л. В мерную колбу вместимостью 1 л вносят 60 мл ледяной уксусной кислоты и доводят объем до метки;
натрия гидроксид (ч. д. а., х. ч.), 1 моль/л; полиоксиэтиленлауриловый эфир (бридж 35); ацетатный буфер, 0,05 моль/л, pH 4,2 с добавлением детергента. 0,85 г бриджа 35 растворяют в 200 мл воды, добавляют 50 мл 1 моль/л раствора уксусной кислоты, 13,2 мл 1 моль/л раствора натрия гидроксида и доводят объем водой до 1 л. Перемешивают, проверяют pH. Реактив стабилен при хранении в холодильнике;
бромкреозоловый зеленый (БКЗ) водорастворимый индикатор (ч. д. а.). 1,2 ммоль/л. 0,4292 БКЗ растворяют в 200 мл воды в мерной колбе вместимостью 500 мл и доводят объем до метки. Стабилен при хранении в холодильнике в посуде из темного стекла;
рабочий раствор БКЗ в ацетатном буфере. В мерную колбу вместимостью 1 л вносят 85 мл 1,2 ммоль/л раствора БКЗ, доводят объем до метки ацетатным буфером с детергентом. Стабилен при хранении в холодильнике в посуде из темного стекла;
основной калибровочный раствор альбумина, 10 г на 100 мл. Можно использовать ампулированный 10%-ный раствор альбумина плацентарного.
Оборудование: фотоэлектроколориметр (ФЭК) или спектрофотометр.
Ход определения. 10 мкл сыворотки крови (или 0,1 мл сыворотки, разведенной в 10 раз 0,9%-ным раствором ГЧаС1) тщательно перемешивают, избегая образования пены, с 4 мл рабочего раствора БКЗ в ацетатном буфере. Через 5—10 мин измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 630—690 нм (красный светофильтр) против холостой пробы на реактивы или на спектрофотометре при длине волны 625 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Окраска стабильна в течение 8 ч.
Холостую пробу ставят так же, как опытную, но вместо сыворотки добавляют 0,1 мл воды.
Расчет ведут по калибровочной кривой. Построение калибровочной кривой: готовят ряд разведений основного калибровочного раствора, как указано в таблице 12. Калибровочные растворы обрабатывают так же, как и опытные, но вместо сыворотки добавляют 10 мкл калибровочного раствора. Калибровочная кривая линейна до концентрации альбумина 60 г/л.
12. Приготовление разведений основного калибровочного раствора


пробирки

Основной калибровочный раствор альбумина, мл

Дистиллированная вода, мл

Содержание альбумина в сыворотке, г/л

1

1,0

4,0

20

2

1,5

3,5

30

4

2,0

3,0

40

5

2,5

2,5

50

6

3,0

2,0

60


Источники: 43, 45.
Определение иммуноглобулинов в сыворотке крови по реакции с натрия сульфитом.
Принцип. При взаимодействии иммунных глобулинов сыворотки крови с раствором натрия сульфита изменяется структура белковых молекул и раствор мутнеет с интенсивностью, пропорциональной концентрации иммуноглобулинов.
Реактив: 18%-ный раствор натрия сульфита (№2803, ч. д. а., х. ч.). 18 г вещества растворяют в 82 мл дистиллированной прокипяченной воды.
Оборудование: фотоэлектроколориметр.
Ход определения. В две пробирки вносят по 3,8 мл 18%-ного раствора натрия сульфита и добавляют по 0,1 мл сыворотки крови, смешивают и через 20 мин колориметрируют на ФЭК-56М при синем светофильтре (540 нм) или на КФК-2, КФК-3 при длине волны 400 ± 5 нм в кювете с толщиной слоя 5 мм против 18%-ного раствора натрия сульфита.
Если оптическая плотность (экстинкция) подготовленного образца сыворотки крови выше 1,3—1,5, сыворотку разводят изотоническим раствором натрия хлорида 1 : 1 и повторяют измерение. Полученные результаты параллельных определений складывают и усредняют.
Расчет ведут по калибровочной кривой, построенной с использованием сыворотки крови с известным содержанием иммуно-

13. Содержание иммуноглобулинов (ГС) в сыворотке крови в зависимости от оптической плотности

Оптическая
плотность

Содержание КЗ, мг/мл

Оптическая
ПЛОТНОСТЬ

Содержание Ю, мг/мл

0,1

2,28

0,45

10,00

0,11

2,60

0,50

11,4

0,12

2,92

0,55

12,4

0,125

3,03

0,60

13,6

0,13

3,14

0,65

14,6

0,135

3,37

0,70

15,8

0,14

3,60

0,75

16,8

0,145

3,70

0,80

17,8

0,15

3,80

0,85

19,0

0,155

3,93

0,90

20,2

0,16

4,06

0,95

21,2

0,165

4,17

1,00

22,3

0,17

4,28

1,05

23,4

0,175

4,39

1,1

24,6

0,18

4,50

1,15

25,8

0,185

4,61

1,2

26,8

0,19

4,72

1,25

28,0

0,195

4,83

1,30

29,0

0,20

4,94

1,35

30,1

0,25

5,80

1,40

31,2

0,30

6,80

1,45

32,3

0,35

8,00

1,50

33,4

0,40

9,00




глобулинов. Для этой цели можно пользоваться таблицей Н. А. Кос- тыны (табл. 13).
Примечание. Метод приемлем в основном для определения иммунных глобулинов у новорожденных животных.
Источник: 20.
Определение иммунных белков в сыворотке крови по реакции с цинка сульфатом (цинк-сульфатный тест — ЦСТ). Принцип. При внесении в раствор, содержащий иммунные белки, цинка сульфата изменяется белковая молекула и раствор мутнеет. Степень помутнения раствора прямо пропорциональна содержанию иммуноглобулинов и может быть измерена фотометрическими приборами.
Реактивы: 20,8 мг/100 мл раствор сульфата цинка (х. ч.). Готовят в день исследований на прокипяченной дистиллированной воде (для удаления углекислого газа). Длительному хранению не подлежит;
барий сульфатный — стандарт мутности: 3 мл 1,15%-ного раствора бария хлорида (х. ч.) на дистиллированной воде вносят в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки 0,2%-ным раствором серной кислоты. Полученный раствор соответствует 20 ед. ЦСТ по степени мутности. Для приготовления стандарта 40 ед. мутности в мерную колбу на 100 мл вносят 6 мл 1,15%-ного раствора бария хлорида, а для стандарта с 10 ед. мутности — 1,5 мл. Далее растворяют, как в предыдущем случае. По полученным трем стандартным растворам мутности (10,20, 40 ед.) строят калибровочную кривую для данного прибора (ФЭК).





















Рис. 1. Форменные элементы крови (норма):
А — крупного рогатого скота; ? — овцы; / — базофилы; 2 — эозннофилы; 3 — юные нейтрофилы; 4 — палочкоялерные нейтрофилы; 5 — сегментоялерные нейтюфпы; б, "и 8 — малый, средний и большой лимфоциты; 9и 10— моноциты; //и 12 — клетки Тюрка; 13 — эритроциты и ретикулоциты; 14 — тромбоциты (по Н. П. Рухлядеву)



Плазмоцит

Макрофаги

Гистеоцит соединительной ткани

Купферовы
клетки
печени

Альвеолярный
макрофаг
легких

Свободный и фиксированный макрофаг селезенки

Свободный и фиксированный макрофаг костного мозга


Рис. 11.
Схема кроветворения по И. Л. Черткову и А. И. Воробьеву






















Мокрофоги

Свободный и фиксированный макрофаг лимфатических узлов

Перито
неальный
макрофаг

Плевраль
ный
макрофог

Остео
класт

Клетки
микроглии
нервной
системы








Рис. III. Форменные элементы крови:
/4 — лошади; Б — евниьи: I — базофилы; 2 — эозинофилы;.) - - палочкояаерные нейтрофьаы; 4 — сегчеитояаериые иейтрофилы; 5 и 6 — малый и большой лимфоциты; 7 и 8 — моноциты; 9— клетки Тюрка; 10 — эритроциты; II — тромбоциты (по Н. П. Рухлядеву)




  Рис. IV элементы крови:

  Рис. IV элементы крови:

  Л — кролика; Б — кур; I — базофилы; 2—эозинофилы; 3 — палочкоялерные нейтрофилы; 4—сег- мекгоядерные нейтрофилы; 5и б—малый и большой лимфоциты; 7и 8— моноциты; 9— клетки Тюрка; 10 — эритроциты; II —тромбоциты (по Н. П. Рухлядеву)



  Рис. V. Форменные элементы крови:

  Рис. V. Форменные элементы крови:

  А — верблюда: Б — собаки: / — базофьлы; 2 — эозииофщы: 3 — палочкоялерные иейтрофи- лы; 4—сегментоядерные нейтрофилы: 5 и б — малый и большой лимфоциты: и X— моноциты; 9 — клетки Тюрка; 10 — эритроциты: // — тромбоциты (по Н. П. Рухлядеву)




  Рис. VI. Поражение крови:

  Рис. VI. Поражение крови:

  Рис. VI. Поражение крови:

 

  Рис. VI. Поражение крови:

  А — патологически измененные форменны* лсменты крови; / — вакуолизированна). илетка Тюрка: 2 — гистншшт (ретикgt; ни и юте.:., льная клетка с фагоцитированным эритроцитом и вакуолями): 3 — патологически измененные эритроциты (вверху — три эритроцита с ядрами, в 1евс нижнем углу — эритроцит с тельцами Аолли, рядом в середине — эритроциты с базо- филыл. к зернистостью, остальные эритроциты — различные по величине и по насыщению ге- мо1 юиином): 4— полиморфноядерныИ эритроцит с капельным распадом ядра; 5— миелобласт; 6 — иейтрофильный миелоцит; 7— мегалобласт: 8— пойм юциты (вверху), ретикулошггы (в середине), по..ичроматофилы (внил); 9— миелобластс вакуолями в ядре; 10 — сегментоядерный п ал :к мнофи' г резко выраженной вакуолизацией цитоплазмы (по Н. П. Рухлядеву); Б — лимфоциты крови коровы при лчмфол^икозе










Рис. VII. Картина крови при В12- дефицитной анемии: отмечается гиперхромия, анизоцитоз эритроцитов с преобладанием макроцитов; мегалоциты, мегалобласты, эритроциты с остатками ядра в виде телец Аолли. колец Кебота; эритроциты с базофильнон зернистостью: гнперсегмеитироваииый нейтрофил (по А. Г. Абрамову)

Оборудование: фотоэлектроколориметр; пробирки химические на 5, 10 мл; пипетки на 1,5 и 10 мл; мерные колбы на 100 мл.
Ход определения. В опытную пробирку вносят 6 мл
  1. мг%-ного раствора цинка сульфата, в контрольную — 6 мл дистиллированной воды. В обе пробирки добавляют по 0,1 мл сыворотки крови и выдерживают при комнатной температуре 1 ч, в течение которого содержимое пробирок перемешивают 3 раза. Фо- тометрирование проводят в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 670 нм (красный светофильтр) против контроля. По полученному значению экстинкции на калибровочной кривой находят значение ед. ЦСТ. При пересчете содержания иммунных белков в сыворотке крови можно пользоваться таблицей 14.

  2. 14. Пересчет содержания иммунных белков в сыворотке крови (Н. И. Блинов), мг/ мл


ЦСТ,
ед.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

8,53

9,60

10,67

11,74

12,81

13,88

14,95

16,02

17,09

19,23

20

20,30

21,37

22,44

23,51

24,56

25,65

26,72

27,79

28,86

29,93

30

31,00

32,07

33,14

24,21

35,28

26,35

37,42

38,49

39,56

40,63

40

41,70

42,77

43,83

44,91

45,98

47,05

48,12

49,19

50,26

51,32


Примечание. Сыворотка крови не должна иметь следов гемолиза. Пробирки с сывороткой закрывают резиновыми пробками. Метод преимущественно используют для определения иммунных белков в крови новорожденных животных.
Источники: 9, 29.
 
<< | >>
Источник:   И. П. Кондрахин.   Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник — М.: Колос,. — 520 с.. 2004

Еще по теме   Определение белковых фракций в сыворотке крови. :

  1.   Определение белковых фракций в сыворотке крови турбидимет- рическим (нефелометрическим) методом.  
  2.   Определение витамина Е в сыворотке крови (см. с. 195). Определение церулоплазмина в сыворотке крови.  
  3.   БЕЛКОВЫЙ СОСТАВ СЫВОРОТКИ КРОВИ  
  4.   Определение общего белка в сыворотке крови рефрактометрическим методом.  
  5.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕСТОСТЕРОНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DIAGNOSTICAUTOMATIONINC., США)  
  6.   Определение сиаловых кислот в сыворотке крови по реакции с резорцином. 
  7.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНСУЛИНА В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (DIAGNOSTICSYSTEMLABORATORY, США)  
  8.   Определение свободного аминного азота в сыворотке крови по методу Г. А. Узбекова в модификации 3. С. Чулковой.  
  9.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОРТИЗОЛА В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (DIAGNOSTICSYSTEMLABORATORY, США)  
  10.   Определение каротина в сыворотке (плазме) крови по Карп н Прейсу в модификации Юдкина.