<<
>>

  Определение билирубина в сыворотке крови по диазореакции (метод Ендрассика—Клеггорна—Грофа).  

  Принцип. Под действием НС1 разрывается тетрапирроловая связь билирубина и образуется два дипиррола, которые диазотируются диазобензосульфа- новой кислотой с образованием розово-фиолетового азобилирубина.
Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный — после добавления кофеинового реактива.

Реактивы: кофеиновый реактив. 5 г чистого кофеина, 7,5 г натрия бензоата, 12,5 г натрия ацетата растворяют в 90 мл дистиллированной воды, нагревают до 50—60 °С, хорошо перемешивают. После охлаждения доводят дистиллированной водой до 100 мл. Срок хранения 2 нед;

натрия хлорид (ч. д. а. или х. ч.), 154 моль/л. 0,9 г натрия хлорида помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят водой до метки. НС1 концентрированная (ч. д. а., х. ч.); сульфаниловая кислота (ч. д. а.);

диазореактив I. 5 г сульфаниловой кислоты растворяют при нагревании в 300—400 мл дистиллированной воды, прибавляют 15 мл концентрированной НС1 (плотность 1,19 кг/м3). Если сульфаниловая кислота полностью не растворяется, колбу помещают в теплую воду и помешивают. Только после полного растворения сульфаниловой кислоты и охлаждения раствор доливают дистиллированной водой до 1 л. Реактив стойкий, хранят в посуде из темного стекла;

диазореактив II. Натрия нитрит (№N02, ч. д. а., х. ч.), 5 г/л (0,07 моль/л). 0,5 г натрия нитрата помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят водой до метки. Реактив стабилен в течение 2 нед при хранении в посуде из темного стекла. Перед работой смешивают 10 мл диазореактива I и 0,3 мл диазореактива II;

билирубин для построения калибровочного графика, 800 мг/л, или 1368 мкмоль/л. Коммерческие препараты кристаллического билирубина содержат разные примеси, которые могут мешать реакции азосочетания. Рекомендуется использовать наборы отечественных или зарубежных фирм, содержащие билирубин высокой степени чистоты.

Растворы билирубина нестойкие, поэтому их готовят с добавлением белка в качестве стабилизатора;

натрия карбонат, 0,1 моль/л. 10,6 г безводного №гСОз растворяют и доводят до 1 л дистиллированной водой;

уксусная кислота, 4 моль/л. 25 мл ледяной уксусной кислоты доводят до 100 мл дистиллированной водой.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; колбы мерные.

Ход определения. ВЗ пробирки (для общего и связанного билирубина и для контроля) вносят реактивы, как указано в таблице 16.

  1. Смеси реактивов для определения билирубина в сыворотке крови

Опытная проба, мл

Ингредиент

Общий

Связанный

билирубин

билирубин

Сыворотка крови (негемолизирован- ная)

Кофеиновый реактив

0,5

0,5

0,5

1,75

1,75

Раствор натрия хлорида

1,75

0,25

Диазосмесь

0,25

0,25

Для определения связанного билирубина измерение на фотоэлектроколориметре проводят через 5—10 мин после добавления диазосмеси, так как при длительном стоянии в реакцию вступает несвязанный билирубин.

Для определения общего билирубина пробу для развития окраски оставляют на 20 мин, после чего измеряют на ФЭКе. В дальнейшем окраска не изменяется.

Измерение проводят при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против воды. Из показателей, полученных при колориметрировании общего и связанного билирубина, вычитают показатель контроля.

Расчет ведут по калибровочному графику. Находят содержание общего и связанного билирубина. Для определения уровня непрямого билирубина вычитают из показателя общего его содержания показатель прямого билирубина.

Способ 1. Калибровочный график строят по способу Шелон- га—Венде с использованием стабилизирующего свойства белка сыворотки крови.

Реактивы для построения калибровочного графика. 1. Основной раствор билирубина. Препараты кристаллического билирубина отличаются по своим свойствам. Не каждый билирубин может быть использован для построения калибровочного графика. Допустим лишь тот билирубин, 1 мг%-ный раствор которого при растворении в хлороформе (для наркоза) при 25 °С дает на спектрофотометре абсорбцию от 1,01 до 1,07 при длине волны 453 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

В колбе вместимостью 50 мл растворяют 40 мг билирубина (имеющийся в продаже билирубин является непрямореагирую- щим) в 30—35 мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия (10,6 г безводного Иа2СОз доводят до 1 л дистиллированной водой) и хорошо перемешивают, не допуская образования пузырьков. Доводят до 50 мл 0,1 моль/л раствором ИагСОз и несколько раз перемеши

вают. Раствор стоек только в течение 10 мин от начала приготовления. В дальнейшем билирубин окисляется.

  1. Рабочий раствор билирубина. К 13,9 мл свежей негемолизи- рованной сыворотки крови добавляют 2 мл свежеприготовленного раствора билирубина и 0,1 мл (4 моль/л) раствора уксусной кислоты (25 мл ледяной уксусной кислоты доводят до 100 мл дистиллированной водой). Хорошо перемешивают. При этом выделяются пузырьки углекислого газа. Рабочий раствор стоек в течение нескольких дней. Он содержит на 10 мг% билирубина больше, чем сыворотка, взятая для приготовления раствора. Чтобы исключить при расчетах количество билирубина, содержащегося в этой сыворотке крови, при измерении на ФЭКе из величины экстинкции калибровочных проб вычитают величины экстинкции соответствующих разведений компенсационной жидкости.

Для приготовления компенсационной жидкости смешивают

  1. мл той же сыворотки, которая использовалась для приготовления калибровочного раствора билирубина, 2 мг 0,1 моль/л раствора ИагСОз и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты.

Для построения калибровочного графика готовят ряд разведений с различным содержанием билирубина (табл. 17).

17. Разведения билирубина для построения калибровочного графика

N5

пробир

ки

Рабочий раствор билирубина, мл

0,9%-ный раствор натрия хлорида, мл

Количество билирубина в пробе

Концентрация билирубина в сыворотке крови, мкмоль/л

мг

мкмоль/л

1

0,05

0,45

0,005

0,00855

17,1

2

ОД

0,4

0,01

0,0171

34,2

3

0,15

0,35

0,015

0,02565

51,3

4

0,2

0,3

0,02

0,0342

68,4

5

0,25

0,25

0,025

0,04275

85,5

К полученным разведениям прибавляют по 1,75 мл кофеинового реактива и по 0,25 мл диазосмеси. При появлении помутнения можно добавить по 3 капли 30%-ного раствора натрия гидроксида. Измерение проводят при тех же условиях, что и в опытных пробах, через 20 мин. Из компенсационной жидкости готовят разведения аналогично калибровочным (см. табл. 17) и далее обрабатывают их так же, как калибровочные пробы.

Способ 2. Калибровочный график строят по готовым наборам реактивов, выпускаемых отечественными и зарубежными фирмами. Калибровочная кривая линейна до 170 мкмоль/л.

Подбор реактивов в коммерческих наборах основан также на диазореакции, положенной в основу метода Ендрассика—Клеггор- на—Грофа.

Примечание. Сыворотка или плазма крови должны быть свежими, свободными от гемолиза, прозрачными. Плазму или сыворотку крови хранят не более двух дней при температуре 4—25 °С. Исследования проводят незамедлительно. Образцы крови защищают от света.

Источник: 43.

 

<< | >>
Источник:   И. П. Кондрахин.   Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник — М.: Колос,. — 520 с.. 2004

Еще по теме   Определение билирубина в сыворотке крови по диазореакции (метод Ендрассика—Клеггорна—Грофа).  :

  1.   Определение билирубина в сыворотке крови животных по методу Ендрассика—Клеггорна—Грофа в модификации В. И. Левченко и В. В. Влизло. 
  2.   Определение общего белка в сыворотке крови рефрактометрическим методом.  
  3.   Определение активности а-амилазы в сыворотке крови, моче, дуоденальном содержимом амилоклассическим методом со стойким крахмальным субстратом (метод Каравея).  
  4.   Определение белковых фракций в сыворотке крови турбидимет- рическим (нефелометрическим) методом.  
  5.   Определение витамина Е в сыворотке крови (см. с. 195). Определение церулоплазмина в сыворотке крови.  
  6.   Определение свободного аминного азота в сыворотке крови по методу Г. А. Узбекова в модификации 3. С. Чулковой.  
  7.   Определение токоферолов в тканях и сыворотке крови методом колоночной хроматографии. 
  8.   Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови по гидролизу р-глицерофосфата (метод Бодански).  
  9.   Определение активности сорбитолдещдрогеназы (СДГ) в сыворотке крови по реакции с резорцином (метод Севела—Товарека). 
  10.   Определение белковых фракций в сыворотке крови. 
  11.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕСТОСТЕРОНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DIAGNOSTICAUTOMATIONINC., США)  
  12.   Определение сиаловых кислот в сыворотке крови по реакции с резорцином. 
  13.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНСУЛИНА В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (DIAGNOSTICSYSTEMLABORATORY, США)