<<
>>

  Определение железа в сыворотке крови по цветной реакции с сульфонированным (3-фенантролином.  

  Принцип. Белки осаждают трихлоруксусной кислотой, которая при прогревании разрушает также комплекс железа с трансферином. Для установления оптимальной величины pH, равной 4,8—5,0, добавляют аммония ацетат, а для восстановления всего железа — гидрозин. Двухвалентное железо образует окрашенный комплекс с р-фенантролином, который переведен в сульфатированную форму добавлением хлор- сульфоновой кислоты.

Реактивы: 20 %-ная трихлоруксусная кислота;

аммония ацетат. 70 г аммония ацетата (СНзСООЙЩ) растворяют в воде, объем доводят до 100 мл.

Препарат гигроскопичен;

гидрозина сульфат, насыщенный раствор. 2,5 г препарата заливают 100 мл воды;

раствор сульфонированного р-фенантролина. В пробирке к 100 мг Р-фенантролина (4,7-дифинил-1,10-фенантролина) приливают 0,5 мл хлорсульфоновой кислоты, нагревают на кипящей водяной бане 30 с, охлаждают и медленно приливают 10 мл воды.

После этого снова нагревают на водяной бане 5 мин и разбавляют 100 мл воды. Добавляют 5 моль/л NaOH, устанавливают pH 4 и доводят объем водой до 200 мл;

калибровочный раствор железа, содержащий 30 мкмоль/л. Сначала готовят раствор соли Мора [железоаммонийные квасцы, аммоний-железа сульфат — FeS04 • (NH4)S04 • 6Н20], содержащий

  1. ммоль/л: растворяют 1,178 г в 5 мл 0,3 моль/л НС1 и доводят объем до 1 л водой, содержащей в 1 л 1 мл концентрированной серной кислоты. Этот раствор разводят подкисленной водой в 100 раз; получается раствор, содержащий 30 мкмоль/л, или 1,67 мкг/мл железа.

Ход определения. К2 мл сыворотки крови (без следов гемолиза) прибавляют 2,5 мл воды, 1,5 мл 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и ставят на 15 мин в водяную баню температурой 90—95 °С. Затем центрифугируют 20 мин при 2000—3000 мин-1 и отбирают 4 мл прозрачного слоя, к которому приливают 0,35 мл 70%-ного раствора аммония ацетата и 0,3 мл раствора сульфата гидрозина. Смесь фотометрируют при длине волны 535 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см, затем прибавляют 0,4 мл раствора сульфонированного ?-фенантролина, оставляют на 1 ч и снова фотометрируют при той же длине волны. Обе фотометрии выполняют против холостой пробы, для которой вместо исследуемой сыворотки берут 2 мл воды. Калибровку проводят так же, как и основной опыт, но вместо сыворотки берут 2 мл калибровочного раствора.

Расчет сывороточного железа ведут по формуле

v _ ^onl ^оп2 . -зп

Л              r r              J”)

Як1 - ^к2

где х — количество сывороточного железа, мкмоль/л; ?оп1 и Еоп2 — отсчеты опытной пробы до и после прибавления раствора сульфонированного ?-фенантролина; Екj, ?к2 — соответственно результаты калибровочной пробы; 30 — содержание железа в калибровочном растворе, мкмоль/л.

Примечания. 1. Время между взятием крови и получением сыворотки не должно превышать 2 ч. При комнатной температуре при хранении в закрытой пробирке железо в сыворотке стабильно 7 дней, при 4—8 °С —

  1. нед, при —20 °С — около 1 года. 2. Лабораторную посуду рекомендуется промывать 1%-ным раствором ЭДТА с последующим отмыванием бидистиллированной водой. 3. Если после удаления белков не удается набрать точно 4 мл надосадочной жидкости, можно взять меньшее ее количество и сделать поправку при расчете или же взять точно такое же количество калибровочного раствора.

Определение железа в сыворотке крови можно проводить с использованием набора реактивов фирмы «Ла-Хема» (Чехия).

Клиническое значение. Так как подавляющая часть железа находится внутри эритроцитов и входит в состав гемоглобина, определение его в цельной крови не имеет практического значения. Представление о его количестве можно сделать по определению гемоглобина. Большее клиническое значение имеет определение железа в плазме (сыворотке) крови, где содержание его в несколько раз ниже, чем в цельной крови.

Состояние обмена железа объективно характеризует количество негеминного сывороточного железа, т. е. трансферрина, феррити- на и гемосидерина, так как это основной резерв, который используется организмом в случае необходимости.

Трансферрин — растворимый в воде железопротеин, гликопротеин с содержанием около 0,13 % железа. Он служит физиологическим переносчиком железа в организме.

Ферритин — железосодержащий белок (металлопротеин) с содержанием железа около 20 %. Он сосредоточен главным образом в селезенке, печени, костном мозге, выполняет роль депо железа в организме.

Гемосидерин — водонерастворимый железосодержащий белковый комплекс, в состав которого входят нуклеопротеиды и углеводы. Содержится главным образом в ретикулоэндотелиоцитах печени и селезенки.

Определение сывороточного железа проводят для выявления железодефицитного состояния. Унифицированным методом определения сывороточного железа является р-фенантролиновый.

Содержание железа в сыворотке крови животных составляет 110—200 мкг/100 мл. Снижение уровня железа в сыворотке крови свидетельствует о развитии железодефицитной анемии, которая часто отмечается у поросят, телят, щенков, ягнят, жеребят, а также у животных других возрастных групп. Причинами ее могут быть недостаточное, скудное, несбалансированное кормление животных; нарушение всасывания железа из пищеварительного тракта при заболевании желудка и кишечника; хронические рецидивирующие кровопотери из желудочно-кишечного тракта (язвенная болезнь); усиленное потребление железа при беременности; замедление мобилизации и нарушение транспорта железа из депо; гипоси- деринемия при избыточном накоплении железа в клетках РЭС; потеря трансферина при нефротическом синдроме и др.

 

<< | >>
Источник:   И. П. Кондрахин.   Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник — М.: Колос,. — 520 с.. 2004

Еще по теме   Определение железа в сыворотке крови по цветной реакции с сульфонированным (3-фенантролином.  :

  1.   Определение мочевины в сыворотке крови по цветной реакции с диацетилмонооксимом.  
  2.   Определение магния в сыворотке (плазме) крови по цветной реакции с титановым желтым (по Кункелю, Пирсону, Швейгерту в модификации И. В. Петрухина). 
  3.   Определение сиаловых кислот в сыворотке крови по реакции с резорцином. 
  4.   Определение мочевой кислоты в сыворотке крови по реакции с фосфорно-вольфрамовым реактивом. 
  5.   Определение активности сорбитолдещдрогеназы (СДГ) в сыворотке крови по реакции с резорцином (метод Севела—Товарека). 
  6.   Определение витамина Е в сыворотке крови (см. с. 195). Определение церулоплазмина в сыворотке крови.  
  7.   Определение меди и железа в крови по Сенделу в модификации С. Г. Кузнецова. 
  8.   Определение белковых фракций в сыворотке крови. 
  9.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕСТОСТЕРОНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DIAGNOSTICAUTOMATIONINC., США)  
  10.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНСУЛИНА В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (DIAGNOSTICSYSTEMLABORATORY, США)  
  11.   Определение общего белка в сыворотке крови рефрактометрическим методом.  
  12.   Определение белковых фракций в сыворотке крови турбидимет- рическим (нефелометрическим) методом.  
  13.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОГЕСТЕРОНА В СЫВОРОТКЕ ИЛИ ПЛАЗМЕ КРОВИ (DIAGNOSTIC AUTOMATION INC., США)