<<
>>

  ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОРТИЗОЛА В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (DIAGNOSTICSYSTEMLABORATORY, США)  

  Принцип. Метод основан на конкуренции между немеченым антигеном и энзим-меченым антигеном на определенное количество связей с антителом. Количество энзим-меченых антигенов, связанных с антителами, обратно пропорционально концентрации немеченого исследуемого.
Реактивы: 96 микротитрационных ячеек (12 стрипов), внутренние стенки которых покрыты козьей антикроличьей глобулино- вой сывороткой;
кортизол-антисыворотка (голубая) — 1 флакон (11 мл) содержит кроличью антикортизоловую сыворотку в протеиновом (BSA) буфере с нертутным консервантом;
кортизол-стандарты — 1 флакон (0,5 мл), обозначенный А, содержит 0 мкг/дл кортизола; 7 флаконов (по 0,5 мл каждый), обозначенные В—Н, содержат кортизол в протеиновом буфере (BSA) с нертутным консервантом в концентрациях 0,5, 1,5, 4,0, 10,0, 20,0,
  1. и 60 мкг/дл;

кортизол-контроли — 2 флакона (по 0,5 мл каждый) с уровнями I и II содержат кортизол низкой и высокой концентрации в протеиновом буфере сыворотки с нертутным консервантом;
кортизол-энзимный конъюгатный концентрат — 1 ампула (0,3 мл) содержит раствор кортизола в протеиновом буфере с нертутным консервантом. Перед исследованием разводят конъюгат- ным растворителем;
конъюгатный растворитель — 1 флакон (11 мл) содержит основанный на протеине буфер с нертутным консервантом;
ТМБ-хромогенный раствор — 1 флакон (11 мл) содержит раствор тетраметилбензидина (ТМБ) в цитратном буфере с водорода пероксидом;
моющий концентрат — 1 флакон (100 мл) содержит буферные соли с неионным детергентом. Перед использованием разводят в 10 объемах деионизированной или бидистиллированной воды;
стоп-раствор — 1 флакон (11 мл) содержит 0,2 М раствор серной кислоты;
бидистиллированная вода.
Примечание. Все реагенты и пробы перед началом анализа должны быть приведены к комнатной температуре (25 °С) и тщательно перемешаны. Пониженная температура реагентов и проб дает заниженные результаты оптической плотности. Сыворотку (плазму) крови, свободную от гемолиза, можно хранить при 2—8 °С 24 ч или более длительное время при минус 20 °С.
Оборудование: микропланшетный иммуноферментный анализатор Йа1 Рах-2100, настраиваемый на длину волны 450 нм и 600 или 620 нм; инкубатор-шейкер (встряхиватель) Б1а1 Рах-2200, настраиваемый на 500—700 движений в 1 мин; автоматическое промывающее устройство Б1а1 Рах-2600; полуавтоматические дозаторы на 5—50, 50—200 и 200—1000 мкл, наконечники; градуированная лабораторная посуда; фильтровальная бумага для просушивания стрипов; миллиметровая бумага для построения калибровочного графика (при отсутствии программного обеспечения).
Подготовка реагентов к анализу. 1. Энзимный конъюгатный раствор: кортизол-энзимный конъюгатный концентрат развести в чистой посуде конъюгатным растворителем в соотношении 1:50 соответственно количеству используемых ячеек. Если используется вся плашка, необходимо отмерить точно 200 мкл кортизол-эн- зимного конъюгатного концентрата и 10 мл конъюгатного растворителя. Готовят непосредственно перед использованием.
  1. Моющий раствор: 100 мл концентрата моющего раствора в колбе растворить в 900 мл бидистиллированной воды.
  2. Микротитрационные ячейки: отобрать для исследования необходимое количество стрипов с ячейками. Остальные стрипы поместить в защитный влагонепроницаемый пакет с десикантом.

Ход определения.
В используемые ячейки микропланшета дозатором вносят по 25 мкл стандартов, контролей и сыворотки крови. Добавляют по 100 мкл свежеприготовленного энзимного конъюгатного раствора. Осторожно встряхивают штатив с ячейками 5—10 с, перемешивая содержимое ячеек. Дозатором (лучше многоканальным) вносят в каждую ячейку по 100 мкл кортизол-антисыворотки. Микротитрационную плашку со стрипами помещают в инкубатор-шейкер для инкубации (~ 25 °С) в течение 45 мин, одновременно встряхивая со скоростью 500—700 встряхиваний в 1 мин. Используя автоматическое моющее устройство, аспириру- ют и пятикратно тщательно промывают каждую ячейку моющим раствором по 350 мкл, избегая попадания пузырьков воздуха. После этого удаляют остатки жидкости с ячеек, переворачивая плашку на фильтровальную бумагу. В каждую ячейку дозатором добавляют по 100 мкл ТМБ-хромогенного раствора. Закрывают микропланшет и инкубируют ячейки в шейкере (встряхивание с частотой 500—700 движений в 1мин) при t ~ 25 °С 10—15 мин. В каждую ячейку дозатором добавляют по 100 мкл стоп-раствора (0,2 М раствор серной кислоты). Встряхивают плашку 5—10 с.
Измеряют оптическую плотность раствора в ячейках при длине волны 450 и 620 нм (в течение 30 мин после добавления стоп-раствора).
Перед считыванием абсорбции необходимо установить прибор на «0» соответственно с нулевым стандартом (Blank).
Полученные значения стандартов кортизола используют для построения стандартной кривой, по которой определяют концентрацию гормона в исследуемых образцах. Пробы, значения которых превышают наивысший стандарт, необходимо дополнительно развести стандартом 0 мкг/дл и повторно исследовать.
Примечание. Все стандарты приведены в мкг/дл. Для перевода в нмоль/л необходимо мкг/дл • 27,6 = нмоль/л.
Клиническое значение. Кортизол вырабатывается корой надпочечников из холестерола. Стимулируется секреция кортизола адренокортикотропным гормоном гипофиза (АКТГ), выделение которого, в свою очередь, активируется гипоталамическим корти- котропным рилизинг-гормоном (КРГ, кортиколиберином). Секреция кортиколиберина контролируется соответствующими центрами головного мозга. Около 90 % циркулирующего в крови кортизола находится в связанном с глобулином состоянии, остальное количество — в свободном.
Кортизол усиливает синтез белка, в печени стимулирует синтез глюкозы из неуглеводистых источников, прежде всего — из аминокислот (глюконеогенез).
При первичной недостаточности коры надпочечников уменьшается синтез глюко- и минералокортикоидов (кортизола и альдостеро- на), при вторичной, обусловленной снижением секреции АКТГ, — глюкокортикоидов. Гипоадренокортицизм чаще встречается у собак, особенно у самок (80 %) молодого или среднего возраста (датский дог, ротвейлер, пудель, терьер).
Гиперфункция коры надпочечников сопровождается увеличением синтеза кортизола и вызывает развитие синдрома Кушинга. Заболевание встречается у собак, чаще у самок среднего возраста. Выраженную генетическую предрасположенность к болезни имеют собаки пород боксер и пудель. В 80—85 % случаев гиперкортицизм у собак развивается вследствие поражения гипофиза (аденома или гипертрофия).
При первичной недостаточности коры надпочечников уровень кортизола уменьшается, а содержание АКТГ по принципу обратной связи — увеличивается (у собак — больше 50 нмоль/л). Диагностика синдрома Кушинга, вызванного аденомой гипофиза, основана на увеличении уровня АКТГ в сыворотке (плазме) крови.

При опухолях коры надпочечников синтез кортизола увеличен, а АКТГ — уменьшен.
В плазме крови бычков черно-пестрой породы 13—14-месячного возраста, по данным В. П. Радченко (1980), содержится 2,1—4,0 мкг/100 мл кортизола (58,0—110 нмоль/л), у коров на 7—8-м месяцах стельности — 9,8—17,4 нг/мл (Черемисинов с соавт., 1990), за 60—45 дней до отела — 2,9—40,3 (14,1 ± 1,66) нмоль/л, в период половой охоты — 13,3—23,2 нмоль/л (Г. Г. Харута, 1999).
  1.  
<< | >>
Источник:   И. П. Кондрахин.   Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник — М.: Колос,. — 520 с.. 2004

Еще по теме   ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОРТИЗОЛА В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (DIAGNOSTICSYSTEMLABORATORY, США)  :

  1.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНСУЛИНА В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (DIAGNOSTICSYSTEMLABORATORY, США)  
  2.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАРАТИРЕОИДНОГО ГОРМОНА (ПТГ) В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (DIAGNOSTICSYSTEMLABORATORY, США)  
  3.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАЛЬЦИТОНИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DIAGNOSTICSYSTEMLABORATORY, США)  
  4.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОГЕСТЕРОНА В СЫВОРОТКЕ ИЛИ ПЛАЗМЕ КРОВИ (DIAGNOSTIC AUTOMATION INC., США)  
  5.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭСТРАДИОЛА В СЫВОРОТКЕ ИЛИ ПЛАЗМЕ КРОВИ (DIAGNOSTIC AUTOMATION INC., США)  
  6.   9.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТРИЙОДТИРОНИНА (Т3) В СЫВОРОТКЕ ИЛИ ПЛАЗМЕ КРОВИ (DIAGNOSTIC SYSTEM LABORATORY, США) 
  7.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕСТОСТЕРОНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DIAGNOSTICAUTOMATIONINC., США)  
  8.   Определение каротина в сыворотке (плазме) крови по Карп н Прейсу в модификации Юдкина. 
  9.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИРЕОТРОПИНА (ТТГ) В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DYAGNOSTIC SYSTEM LABORATORY, США)  
  10.   Определение содержания Р-липопротеидов в сыворотке (плазме) крови (по Бурштейну в модификации Виноградовой).  
  11.   Определение активности креатинкииазы (КК) в сыворотке (плазме) крови с использованием креатинфосфата в качестве субстрата. 
  12.   Определение содержания неэтерифицированных жирных кислот (НЭЖК) в сыворотке (плазме) крови (по Лауреллу и Тибблингу).  
  13.   Определение магния в сыворотке (плазме) крови по цветной реакции с титановым желтым (по Кункелю, Пирсону, Швейгерту в модификации И. В. Петрухина). 
  14.   Определение витамина Е в сыворотке крови (см. с. 195). Определение церулоплазмина в сыворотке крови.  
  15.   Экспресс-метод обнаружения ацетоновых тел в сыворотке (плазме) крови. 
  16.   9.2.0ПРЕДЕЛЕНИЕТИР0КСИНА(Т4) в сыворотке КРОВИ (DIAGNOSTIC SYSTEM LABORATORY, США)  
  17.   Определение витамина С в плазме крови.  
  18.   Определение токоферолов в плазме крови с а,а'-дипиридилом (2, 2'-дипиридил).