<<
>>

  Определение общего кальция в сыворотке крови комплексоном Арсеназо III.  

  Принцип. Арсеназо III — металлокомплексон из группы диазокомплексообразователей, которые имеют неодинаковое сродство к различным ионам металлов. Наибольшее сродство проявляется к ионам ТЬ,              , Ът, Ри, меньшее — к ио

нам Ва, Са, 8г.

Из этих ионов в сыворотке крови в значительном количестве присутствует только ион Са. При смешивании раствора Арсеназо III и сыворотки крови образуется комплекс кальция с Арсеназо III, который характеризуется поглощением излучения с максимумом 650—670 нм. Интенсивность поглощения прямо пропорциональна концентрации кальция в диапазоне 0,5—3,5 ммоль/л.

Реактивы: Арсеназо III (ч. д. а.);

натрия додецилсульфат (ч.); ледяная уксусная кислота (х. ч.);

натрия ацетат (ч. д. а.);

кальция карбонат безводный (ч. д. а.);

соляная кислота (ч. д. а.).

Рабочие растворы реактивов: 0,1 моль/л ацетатный буфер с pH 4,75. Для приготовления 1 л буфера смешивают 454 мл 0,1 моль/л уксусной кислоты и 500 мл 0,1 моль/л натрия ацетата трехводного. Для приготовления 0,1 моль/л уксусной кислоты 2,86 мл кислоты (I/ = 1,05 г/см , 17,5 н.) вносят в мерную колбу на 500 мл и доводят объем до метки дистиллированной водой. Для приготовления 0,1 моль/л раствора натрия ацетата трехводного

  1. г соли растворяют дистиллированной водой в стаканчике, затем переносят в мерную колбу на 500 мл и доводят объем до метки дистиллированной водой;

стандартный 2,5 ммоль/л раствор кальция: 25 мг кальция углекислого безводного (ч. д. а.) в мерной колбе на 100 мл растворяют 5 мл 0,1 н. соляной кислоты (готовят из фиксанала) и доводят объем до метки дистиллированной водой;

рабочий реактив Арсеназо III; 0,3 ммоль/л Арсеназо III в 0,1 моль/л ацетатном буфере с pH 4,75. Для приготовления 250 мл рабочего реактива 62 мг Арсеназо III растворяют в 250 мл ацетатного буфера, к полученному раствору добавляют 250 мг натрия до- децилсульфата (до 0,1 %).

Оборудование: фотоэлектроколориметр; пробирки по- листироловые; пипетки вместимостью 0,1 и 5 мл.

Ход определения.

К5мл рабочего реактива Арсеназо III добавляют 50 мкл сыворотки (соотношение 1 : 100), смешивают, избегая образования пены. Через 2 мин и позже измеряют оптическую плотность образцов сыворотки крови против рабочего реактива Арсеназо III в кювете с толщиной слоя жидкости 10 мм при длине волны 590 нм. Параллельно готовят стандартную пробу аналогично опытной, но вместо сыворотки добавляют 50 мкл стандартного раствора кальция с содержанием 2,5 ммоль/л.

Концентрацию кальция (Са, ммоль/л) в сыворотке крови рассчитывают по формуле

Са= §= -2,5,

СТ

где Еоп — экстинкция опытной пробы; Е„ — экстинкция стандартной пробы; 2,5 — коэффициент для пересчета в ммоль/л.

Примечания. 1. Исследуемая сыворотка не должна содержать следов гемолиза, алиментарной гиперлипидемии.

  1. Исследование сыворотки крови проводят в течение первых суток после получения при хранении при температуре не более 4 °С. 3. Посуда для определения кальция должна быть химически чистой. Желательно использовать не стеклянную, а полистироловую посуду.

Источник-, метод изложен в описании А. И. Овсянникова, С. А. Конькова, В. К. Гуркало. Измерение содержания кальция в сыворотке крови и других биологических жидкостях комплексоном Арсеназо III [( Клиническая лабораторная диагностика. — Киев, 1999, № 1. — С. 16—18 с изменениями, внесенными М. Л. Лизогубом, Н. Н. Куевдой (Крымский АТУ)]. В описанную методику внесены следующие изменения: концентрация Арсеназо III увеличена до 0,3 ммоль/л вместо 0,15 ммоль/л; в качестве детергента использован натрия додецилсульфат, концентрация которого 0,1 % вместо 0,04 %; определение кальция проводилось в сыворотке крови животных.

Определение общего кальция в сыворотке крови с индикатором мурексидом. Принцип. Мурексид в щелочной среде образует с кальцием непрочное соединение розового цвета. При добавлении к раствору трилона Б образуется стойкое комплексное соединение, розовый цвет переходит в фиолетовый.

Реактивы: 0,005 н.

раствор трилона Б (готовят из стандарт-титра или из 0,1 н. раствора трилона Б): 10 мл 0,1 н. раствора трилона Б в мерной колбе доводят дистиллированной водой до 200 мл. Устойчив 2 мес;
  1. н. раствор натрия гидроксида. 80 г NaOH (ч. д. а., х. ч.) растворяют в 1 л дистиллированной воды;

мурексид (ч. д. а., х. ч.) свежеприготовленный раствор индикатора: 10 мг на 20 мл воды;

кальция карбонат безводный (ч. д. а., х. ч.). Стандартный

    1. моль/л (10 мг%) раствор: 25 мг вещества растворяют в мерной колбе на 100 мл. Пригоден для исследования кальция в крови животных, кроме яйценосной птицы. При исследовании крови кур и другой яйценосной птицы необходимо подготовить 3,8 ммоль/л (15,2 мг%) раствор: 38 мг вещества растворить в мерной колбе на 100 мл.

Оборудование: стаканчики вместимостью 50 мл (лучше полистироловые); микробюретка на 2 мл с оттянутым концом; пипетки.

Ход определения. Стандартная проба: в стаканчик вносят 10 мл дистиллированной воды, 0,2 мл 2 н. раствора щелочи, 0,5 мл раствора кальция карбоната с содержанием 10 мг% кальция и 3 капли свежеприготовленного раствора мурексида. Раствор окрашивается в слабо-розовый цвет. Осторожно титруют раствором трилона Б до появления слабо-фиолетового цвета. Записывают результат.

Проба с сывороткой крови: в стаканчик вносят 10 мл воды, 0,2 мл раствора щелочи, 0,5 мл сыворотки крови и 3 капли раствора мурексида. Появляется слабо-розовое окрашивание. Затем титруют раствором трилона Б до появления слабо-фиолетового цвета, идентичного стандартной пробе.

Расчет ведут по формуле

   

Расчет ведут по формуле


где х — количество кальция, ммоль/л; А — количество раствора трилона Б, пошедшего на титрование образца сыворотки крови, мл; Б — количество раствора, пошедшего на титрования стандарта, мл; 2,5 — коэффициент для перевода в ммоль/л.

Если исчисление кальция идет в мг%, то за коэффициент берут величину 10. При исследовании сыворотки кур-несушек, когда в качестве стандарта взят раствор 3,8 ммоль/л (15,2 мг%), коэффициентами будут величины 3,8 или 15,2.

(Описанная методика апробирована на кафедре терапии и клинической диагностики Крымского государственного агротехноло- гического университета.)

Определение кальция в костной ткани. Предварительно проводят озоление кости. Кость освобождают от мышц, сухожилий, связок и взвешивают. У трубчатых костей отпиливают суставные концы (эпифизы). Каждый из трех частей (два эпифиза и диафиз) распиливают вдоль и поперек на 4 части. Для анализа берут примерно 1/2—1/4 часть массы диафиза и эпифиза. Масса навески зависит от размера кости, но всегда нужно брать одинаковый процент массы каждой части, предназначенной для анализа.

Отобранный материал тщательно дробят и 10—15 г помещают в предварительно прокаленный и взвешенный до постоянной массы большой тигель. Кость обугливают, для чего тигель ставят на электроплитку с асбестовой сеткой (в вытяжном шкафу) и нагревают до тех пор, пока кость не перестанет дымить. Затем тигель помещают в муфельную печь и прокаливают при темно-красном накаливании (450—500 °С) в течении 4—5 ч. Зола после сжигания должна быть светло-серого или белого цвета без примесей частиц угля. После остывания тигель переносят в эксикатор, взвешивают на тех же аналитических весах и вновь ставят в муфельную печь на 1—2 ч, затем снова взвешивают. Разница между первым и вторым взвешиваниями не должна превышать 0,0002 г. При необходимости можно рассчитать содержание сырой золы (х) по формуле

(А-в)-т

Н ’

где А — масса тигля с золой, г; В — масса тигля, г; 100 — коэффициент для пересчета в проценты; Н — навеска, г.

Содержимое тигля переносят в фарфоровую ступку, измельчают в однородную массу. На аналитических весах взвешивают 1 г зольного остатка (лучше в ранее прокаленном и взвешенном тигле). Взятую навеску в том же тигле растворяют в 10 мл 25%-ного раствора соляной кислоты при постоянном перемешивании стеклянной палочкой. Полученный раствор переносят в мерную колбу на 250 мл, тигель несколько раз обмывают дистиллированной водой, которую сливают в ту же колбу, объем ее доводят до метки дистиллированной водой. Содержимое колбы хорошо перемешивают и после отстаивания проводят анализ, как описано в методике определения общего кальция в сыворотке крови.

Источник: 21.

Определение ионизированного кальция расчетным методом (по И. Тодорову). Ионизированный кальций определяют вычислением по формуле

?а2+ = 6Са- Б/3 Б+ 6 ’

где Са2+ — ионизированный кальций, мг%; Са — общий кальций, мг%; Б — общий белок, г%.

Для вычисления ионизированного кальция необходимо знать количество общего кальция и общего белка сыворотки крови.

Источник: 68.

Определение ионизированного кальция с применением обменной адсорбции (по Д. Т. Волкову). В качестве адсорбента используют нейтральный алюминия оксид, стандартизированный по Брохма- ну, II степени активности. Ионизированный кальций устанавливают по разнице между общим кальцием и кальцием, не вступившим в ионный обмен. Последний определяют следующим образом: берут 2,5 мл плазмы (сыворотки) крови, добавляют 50 мг адсорбента из расчета 20 мг алюминия оксида на 1 мл плазмы (сыворотки) крови. Содержимое пробирки тщательно перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют 5 мин при 3000 мин . Надоса- дочный раствор осторожно сливают в пробирку, не допуская взмучивания осадка. Затем определяют содержание кальция в 0,1 мл полученного раствора по вышеописанной методике определения общего кальция. В плазме крови концентрация ионизированного кальция ниже, чем в цельной крови и сыворотке.

Источник: 12.

Примечание. В качестве антикоагулянта используют гепарин.

Са2+ стабилен в цельной крови при 4—8 °С в герметически закрытых шприцах в течение 2 ч. Не допускается контакт крови с воздухом.

Для измерения содержания ионизированного кальция крови и мочи используются ионоселективные анализаторы, которые производят зарубежные фирмы «Radiometer» (Дания), «Novabimedical» и «Beckman-Conlter» (США), «AVL» (Австрия).

Клиническое значение. В крови циркулирует кальций в трех формах: 45—50 % находится в ионизированном состоянии, 40—45 % связано с белками, остальное количество образует комплексы с различными моно- и бивалетными низкомолекулярными анионами. Физиологически активен ионизированный кальций.

Уровень общего кальция в крови определяется суммой ионизированного связанного с белками крови и различными анионами кальция. Определения только общего кальция для характеристики нарушений метаболизма недостаточно.

Преимущественно кальций — внеклеточный элемент. Около

  1. % его находится в костной ткани в составе гидрооксиапатита, остальное количество — во внеклеточной жидкости.

Кальций — один из важнейших компонентов системы, регулирующей проницаемость мембран. Его ионы способствуют взаимодействию актина и миозина, т. е. сокращению мышечных волокон. Это осуществляется с участием магния и АТФ. В нервно-мышечных синапсах ионы кальция способствуют выделению ацетилхоли- на и связыванию его с холин-рецептором, а при избытке ацетил- холина активизируют холинэстеразу, расщепляющую ацетилхо- лин. Ион кальция активизирует процесс свертывания крови.

Всасывание, транспортировка, распределение в тканях и выделение кальция протекают с участием активных форм витамина О и паратгормона.

Уровень кальция в крови здоровых животных указан в приложениях 5 и 6. Он зависит от содержания кальция, фосфора и витамина А в рационе, состояния гормональной системы, желудоч- но-кишечного тракта, почек, печени и других органов.

Снижете содержания кальция в крови отмечается при длительном недостаточном поступлении его с кормом, плохом усвоении вследствие дефицита витамина Б и паратгормона, которые обеспечивают его всасывание в кишечнике и препятствуют выведению с мочой. Гипокальциемия сопровождает алиментарную остеодистрофию, рахит, вторичную остеодистрофию и многие другие болезни. Уровень кальция в крови стабильно удерживается длительное время за счет мобилизации его из костной ткани. Компенсаторные механизмы проявляются при развитии алиментарной остеодистрофии и рахита, при которых низкое количество кальция в крови обнаруживают при затяжном, тяжелом течении патологического процесса.

Снижение уровня кальция в крови при вторичной остеодистрофии связано, вероятно, с гипофункцией околощитовидных желез и недостаточным синтезом паратгормона.

Резко выраженную гипокальциемию наблюдают при послеродовом парезе. Объясняется такое явление, очевидно, гиперсекрецией кальцитонина, вырабатываемого С-клетками щитовидной железы, который в противоположность паратгормону способствует минерализации кости и понижает уровень кальция в крови.

Причиной гипокальциемии может быть гипофункция околощитовидных желез. Так как кальций участвует в нервно-мышечном возбуждении, то при его резком снижении появляются тонические, клонические судороги и парезы.

Гипокальциемия возможна при гломерулонефрите, интерстициальном нефрите, когда наступает гипопротеинемия, а следовательно, потеря связанного с белком кальция; при остром панкреатите из-за избытка глюкогона; опухоли щитовидной железы в связи с избыточной продукцией кальцитонина.

Повышение содержания кальция в крови может быть при передозировке витамина Б, гиперфункции паращитовидных желез, длительном применении антоцидов при язвенной болезни.

 

<< | >>
Источник:   И. П. Кондрахин.   Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник — М.: Колос,. — 520 с.. 2004

Еще по теме   Определение общего кальция в сыворотке крови комплексоном Арсеназо III.  :

  1.   Определение общего белка в сыворотке крови рефрактометрическим методом.  
  2.   Определение витамина Е в сыворотке крови (см. с. 195). Определение церулоплазмина в сыворотке крови.  
  3.   Определение общего рибофлавина в крови.  
  4.    Флуориметрический метод определения общего тиамина в крови и печени (по Г. Д. Елисеевой).  
  5.   Определение белковых фракций в сыворотке крови. 
  6.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕСТОСТЕРОНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DIAGNOSTICAUTOMATIONINC., США)  
  7.   Определение сиаловых кислот в сыворотке крови по реакции с резорцином. 
  8.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНСУЛИНА В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (DIAGNOSTICSYSTEMLABORATORY, США)  
  9.   Определение белковых фракций в сыворотке крови турбидимет- рическим (нефелометрическим) методом.  
  10.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОРТИЗОЛА В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (DIAGNOSTICSYSTEMLABORATORY, США)  
  11.   Определение билирубина в сыворотке крови животных по методу Ендрассика—Клеггорна—Грофа в модификации В. И. Левченко и В. В. Влизло. 
  12.   Определение мочевины в сыворотке крови по цветной реакции с диацетилмонооксимом.  
  13.   Определение свободного аминного азота в сыворотке крови по методу Г. А. Узбекова в модификации 3. С. Чулковой.  
  14.   Определение каротина в сыворотке (плазме) крови по Карп н Прейсу в модификации Юдкина. 
  15.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИРЕОТРОПИНА (ТТГ) В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DYAGNOSTIC SYSTEM LABORATORY, США)  
  16.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАЛЬЦИТОНИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DIAGNOSTICSYSTEMLABORATORY, США)  
  17.   Определение содержания Р-липопротеидов в сыворотке (плазме) крови (по Бурштейну в модификации Виноградовой).  
  18.   Определение железа в сыворотке крови по цветной реакции с сульфонированным (3-фенантролином.  
  19.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОГЕСТЕРОНА В СЫВОРОТКЕ ИЛИ ПЛАЗМЕ КРОВИ (DIAGNOSTIC AUTOMATION INC., США)  
  20.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭСТРАДИОЛА В СЫВОРОТКЕ ИЛИ ПЛАЗМЕ КРОВИ (DIAGNOSTIC AUTOMATION INC., США)