<<
>>

  ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕСТОСТЕРОНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DIAGNOSTICAUTOMATIONINC., США)  

  Принцип. Метод основан на конкурентном связывании тестостерона исследуемой сыворотки и конъюгата тестостерона-ПХ с постоянным количеством кроличьего антитестостерона. В ячейки, покрытые антикроличьими IgG, вносят по 10 мкл тестостероновых стандартов, контролей и исследуемых проб сыворотки, добавляют 100 мкл конъюгата тестостерона-ПХ и 50 мкл кроличьего антитес- тостеронового реагента.
Инкубируют при 37 °С. Во время инкубации известное количество меченного ПХ тестостерона конкурирует с эндогенным тестостероном в стандарте, пробе или контрольной сыворотке за определенное число мест связывания на специфических антителах к тестостерону. При этом количество связанного меченного пероксидазой тестостерона обратно пропорционально содержанию эндогенного тестостерона в исследуемой сыворотке. Несвязанный конъюгат меченого тестостерона вымывают из ячеек. После этого в ячейки добавляют ТМБ-реагент. Развитие окраски прекращают добавлением стоп-раствора (кислоты хлористоводородной) и измеряют абсорбцию на ридере при длине волны 450 нм.
Реактивы: 96 микротитрационных ячеек, покрытых козьими антикроличьими IgG;
референс-стандарты тестостерона — 6 флаконов по 0,5 мл с концентрациями 0,0, 0,1, 0,5, 2,0, 6,0 и 18 нг/мл. Готовы к использованию;
кроличий антитестостероновый реагент (розового цвета) —
  1. флакон (7 мл);

конъюгат тестостерона и ПХ (голубого цвета) — 1 флакон (12 мл);
тестостероновые контроли — 2 флакона по 0,5 мл с уровнями I и II. Готовы к использованию;
ТМБ-реагент — 1 флакон (11 мл);
стоп-раствор (кислота хлористоводородная) — 1 флакон (11 мл); деионизированная или бидистиллированная вода.
Примечания. Материалом для исследования служит сыворотка или плазма без гемолиза и липидемии. Антикоагулянт — гепарин. Образец крови помещают в воду со льдом и тотчас центрифугируют, отделяют сыворотку или плазму, охлаждают в холодильнике или замораживают при минус 20 °С. Сыворотку или плазму хранят 1 день при комнатной температуре, 3 дня при 4—8 °С и 1 год при минус 20 °С. Оборудование: микроплашечный иммуноферментный анализатор (ридер); инкубатор-шейкер для микропланшет; автоматическое промывающее устройство; полуавтоматические пипетки на
  1. 50, 100 мкл и 1,0 мл; фильтровальная бумага или бумажные салфетки для просушивания стрипов; миллиметровая бумага.

Подготовка реагентов к анализу. Перед использованием все реагенты и пробы необходимо привести к комнатной температуре (18—25 °С). Сыворотки, в которых уровень тестостерона свыше 18 нг/мл, следует развести разбавителем сыворотки.
Ход определения. Закрепляют в штативе необходимое количество ячеек. Вносят по 10 мкл стандартов, контролей и исследуемых проб (в параллелях) в соответствующие ячейки. Добавляют в каждую ячейку по 100 мкл конъюгата тестостерона ПХ и по 50 мкл кроличьего антитестостеронового реагента. Тщательно и аккуратно перемешивают в течение 30 с. Инкубируют в инкубато- ре-шейкере при 37 °С на протяжении 90 мин. При помощи автоматического промывающего устройства исследуемые ячейки 5 раз промывают бидистиллированной водой. Остатки жидкости в ячейках удаляют, переворачивая и постукивая плашкой по фильтровальной бумаге. Вносят в каждую ячейку по 100 мкл ТМБ-хромо- генного раствора, осторожно перемешивают в течение 5 с. Инкубируют при комнатной температуре (18—25 °С) 20 мин. Добавляют в каждую ячейку по 100 мкл стоп-раствора. Осторожно перемешивают 30 с. Очень важно, чтобы голубая окраска полностью перешла в желтую. Считывают абсорбцию на ридере при длине волны 450 нм в течение 15 мин.
По полученным результатам стандартов строят калибровочную кривую и по ней определяют концентрацию гормона в исследуемых пробах сыворотки. При подсчете результаты предварительно разведенных образцов умножают на фактор разведения.
Клиническое значение. Тестостерон — это наиболее активный мужской половой гормон, который вырабатывается главным образом интерстициальными клетками семенников; у самок — в надпочечниках, фолликулах, желтом теле, однако в 10—15 раз меньшем количестве. Секрецию тестостерона стимулируют гонадотропные гормоны: фолликулотропин и лютеотропин. У самцов тестостерон специфически действует на развитие и функцию органов размножения, созревание спермиев и сохранение их жизнеспособности, развитие вторичных половых признаков. Кроме того, повышает основной обмен, усиливает синтез белков (оказывает анаболическое действие).
Повышение уровня тестостерона наблюдают при патологии ги- поталамогипофизарной системы, опухолях семенников и яичников, гиперплазии надпочечников.
При недостаточной секреции тестостерона, фолликулотропина (ФСГ), лютеотропина (ЛГ) развивается гипогонадизм. Различают первичный и вторичный гипогонадизм. Причинами первичного являются врожденные аномалии, которые сопровождаются недостаточным развитием семенников и мошонки, двусторонний крипторхизм или орхит, инфекционный эпидидимит баранов. Вторичный гипогонадизм вызывает недостаточная секреция гонадотропных гормонов — ФСГ и ЛГ.
В сыворотке крови коров в период половой охоты содержание тестостерона составляет в среднем 116,8 ± 9,0 пг/мл (В. С. Шипи- лов с соавт., 1987), на 7-м месяце стельности 241,4 ± 40,7 пг/мл (К. Г. Дашукаева, 1992), за месяц до отела 6,0—7,0 нмоль/л и через 15—30 дней после отела — 3,2—3,5 нмоль/л (В. И. Еременко, 2000).
  1.  
<< | >>
Источник:   И. П. Кондрахин.   Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник — М.: Колос,. — 520 с.. 2004

Еще по теме   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕСТОСТЕРОНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DIAGNOSTICAUTOMATIONINC., США)  :

  1.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНСУЛИНА В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (DIAGNOSTICSYSTEMLABORATORY, США)  
  2.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОРТИЗОЛА В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (DIAGNOSTICSYSTEMLABORATORY, США)  
  3.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАЛЬЦИТОНИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DIAGNOSTICSYSTEMLABORATORY, США)  
  4.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИРЕОТРОПИНА (ТТГ) В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DYAGNOSTIC SYSTEM LABORATORY, США)  
  5.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОГЕСТЕРОНА В СЫВОРОТКЕ ИЛИ ПЛАЗМЕ КРОВИ (DIAGNOSTIC AUTOMATION INC., США)  
  6.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭСТРАДИОЛА В СЫВОРОТКЕ ИЛИ ПЛАЗМЕ КРОВИ (DIAGNOSTIC AUTOMATION INC., США)  
  7.   9.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТРИЙОДТИРОНИНА (Т3) В СЫВОРОТКЕ ИЛИ ПЛАЗМЕ КРОВИ (DIAGNOSTIC SYSTEM LABORATORY, США) 
  8.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАРАТИРЕОИДНОГО ГОРМОНА (ПТГ) В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (DIAGNOSTICSYSTEMLABORATORY, США)  
  9.   Определение витамина Е в сыворотке крови (см. с. 195). Определение церулоплазмина в сыворотке крови.  
  10.   9.2.0ПРЕДЕЛЕНИЕТИР0КСИНА(Т4) в сыворотке КРОВИ (DIAGNOSTIC SYSTEM LABORATORY, США)  
  11.   Определение белковых фракций в сыворотке крови. 
  12.   Определение сиаловых кислот в сыворотке крови по реакции с резорцином. 
  13.   Определение общего белка в сыворотке крови рефрактометрическим методом.  
  14.   Определение белковых фракций в сыворотке крови турбидимет- рическим (нефелометрическим) методом.  
  15.   Определение общего кальция в сыворотке крови комплексоном Арсеназо III.  
  16.   Определение мочевины в сыворотке крови по цветной реакции с диацетилмонооксимом.  
  17.   Определение свободного аминного азота в сыворотке крови по методу Г. А. Узбекова в модификации 3. С. Чулковой.  
  18.   Определение каротина в сыворотке (плазме) крови по Карп н Прейсу в модификации Юдкина.