<<
>>

  ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИРЕОТРОПИНА (ТТГ) В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DYAGNOSTIC SYSTEM LABORATORY, США)  

  Принцип. Определение тиреотропина основано на энзимсвя- занном одношаговом сендвичеподобном иммуноанализе. Стандарты, контроли и исследуемые образцы сыворотки крови инкубируют в микротитрационных ячейках, покрытых антит-чТТГ-антите- лами с другими антит-чТТГ-антителами, меченными энзимами пероксидазы хрена (ПХ).
После промывания ячейки инкубируют с субстратом тетраметилбензидина (ТМБ), добавляют кислотный стоп-раствор и определяют степень энзимного оборота субстрата путем измерения абсорбции при двойном излучении на длине волны 450 и 620 нм. Показатели абсорбции исследуемых образцов прямо пропорциональны концентрации ТТГ в пробе.

Реактивы: 96 полистириновых микротитрационных ячеек, покрытых анти-чТТГ-антителами;

ТТГ-стандарты — 1 флакон (А, 1 мл) содержит 0 мкМЕ/мл, 5 флаконов по 0,5 мл (В—F) с концентрациями 0,15, 0,70, 2,00, 7,50 и 22,00 мкМЕ/мл ТТГ в сыворотке свиньи с нертутным консервантом;

ТТГ-контроли — 2 флакона по 0,5 мл каждый. Уровни I и II содержат высокую и низкую концентрации ТТГ в сыворотке свиньи с нертутным консервантом;

аналитический буфер В — 1 флакон (11 мл) содержит протеиновый буфер с нертутным консервантом;

ТТГ-антител-энзимный конъюгатный концентрат — 1 флакон из темного стекла (0,3 мл) содержит анти-чТТГ-антитела, конъюгированные с энзимами пероксидазы хрена в протеиновом буфере с нертутным консервантом (перед использованием необходимое количество концентрата в зависимости от количества исследуемых образцов растворяют в конъюгатном растворителе;

ТМБ-хромогенный раствор — 1 флакон (11 мл) содержит тетра- метилбензидин в цитратном буфере с пероксидом водорода;

моющий концентрат — 1 флакон (100 мл) содержит буферный солевой раствор с неионным детергентом. Перед использованием разводят в 10 частях деионизированной или бидистиллированной воды;

стоп-раствор — 1 флакон (11 мл) содержит 0,2 М раствор серной кислоты;

бидистиллированная вода.

Примечание.

Все реагенты и пробы перед исследованием следует привести к комнатной температуре (25 °С) и, осторожно вращая, тщательно перемешать. Сыворотку крови хранят не более 24 ч в холодильнике при 2—8 °С. Для более длительного хранения исследуемые образцы замораживают и хранят при минус 20 °С и ниже. Не рекомендуется исследовать гемолизированные и липемичные образцы. Пробирку с кровью после взятия пробы тотчас помещают в воду со льдом и немедленно доставляют в лабораторию или отделяют сыворотку или плазму, или замораживают и в замороженном виде доставляют в лабораторию. Антикоагулянт — гепарин, а не ЭДТА.

Оборудование: микропланшетный иммуноферментный анализатор Рах-2100, настраиваемый на длину волны 450 нм и перенастраиваемый на 600 и 620 нм; инкубатор-шейкер (встряхиватель) Рах-2200, настраиваемый на 500—700 движений/мин; автоматическое промывающее устройство Рах-2600; полуавтоматические пипетки на 50 и 100 мкл, наконечники; градуированная лабораторная посуда, полистириновые пробирки; фильтровальная бумага для просушивания стрипов; миллиметровая бумага для построения калибровочного графика (при отсутствии программного обеспечения).

Подготовка реагентов к анализу. 1. Антител-энзимный конъ- югатный раствор: антител-энзимный конъюгатный концентрат развести в аналитическом буфере (1 : 50), исходя из числа используемых ячеек (при использовании плашки на 96 ячеек 220 мкл конъюгатного концентрата разводят в 11 мл аналитического буфера). Разводят его непосредственно перед исследованием.

  1. Моющий раствор: 100 мл моющего концентрата растворить в 900 мл бидистиллированной воды. Раствор стабилен при комнатной температуре в посуде из темного стекла в течение 1 мес.
  2. Микротитрационные ячейки: отобрать для исследования необходимое количество стрипов, а остальные стрипы поместить в защитный влагонепроницаемый пакет с десикантом.

Ход определения. Перед использованием все реагенты и пробы должны быть приведены к комнатной температуре (~ 25 °С).

Образцы сыворотки крови, стандарты и контроли необходимо исследовать в параллельных пробах.

В используемые ячейки микротитрационных стрипов пипеткой вносят по 50 мкл стандартов, контролей и исследуемой сыворотки крови.

В каждую ячейку добавляют по 100 мкл свежеприготовленного антител-энзимного конъюгатного раствора. Микротитраци- онную плашку со стрипами помещают в инкубатор-шейкер для инкубации (t ~ 25 °С) в течение 90 мин, одновременно встряхивая со скоростью 500—600 движений в 1 мин. Используя автоматическое моющее устройство, пятикратно аспирируют и тщательно промывают каждую ячейку моющим раствором по 350 мкл, используя программу № 3 вошера. После этого удаляют остатки жидкости с ячеек, переворачивая плашку на фильтровальную бумагу. Полуавтоматической пипеткой (лучше использовать 8-канальную) в каждую ячейку добавляют по 100 мкл ТМБ-хромогенного раствора и инкубируют ячейки при комнатной температуре (~ 25 °С) в течение 10 мин, одновременно встряхивая в инкубаторе-шейкере со скоростью 500—600 движений в 1 мин.

По окончании инкубации в каждую ячейку пипеткой добавляют по 100 мкл стоп-раствора (0,2 М раствор серной кислоты) для прерывания реакции и развития окрашивания. Помещают плашку со стрипами в иммуноферментный анализатор (ридер) для измерения абсорбции раствора в ячейках при длине волны 450 нм (в течение 30 мин после добавления стоп-раствора). Перед учетом абсорбции микротитрационных ячеек необходимо установить прибор на «0» в соответствии с нулевым стандартом (Blanc). При возможности для более точного измерения абсорбции необходимо установить прибор на измерение двойного излучения при длине волны 450 нм с последующей перенастройкой на 600 или 620 нм.

Полученные значения стандартов ТТГ используют для построения стандартной кривой, по которой определяют концентрацию тиреотропина в исследуемых образцах.

Примечание. Все стандартные растворы приведены в мкМЕ/мл.

Для перевода в мМЕ/л необходимо мкМЕ/мл х х 1,0 = мМЕ/л.

Клиническое значение. ТТГ секретируется аденогипофизом. Он стимулирует поглощение щитовидной железой йодида из крови, усиливает синтез тиреоглобулина и его распад с высвобождением Тз и Т4 в кровь. Секреция тиреоидных гормонов после выделения ТТГ возрастает уже через несколько минут. Уровень ТТГ в крови менее 5 мМЕ/л (1—4 нг/мл, или 0,6—3,8 мкг/л) на протяжении суток не меняется, и поэтому даже разовое определение его дает полезную клиническую информацию. Продукция гипофизарного ТТГ, в свою очередь, находится под контролем гипо- таламических гормонов — стимулирующего тиреотропин-рилизинг гормона (ТРГ) и ингибирующего соматостатина.

ТТГ является маркером при оценке функционального состояния щитовидной железы. В основе регуляции секреции ТТГ лежит механизм обратной связи: высокие концентрации Т3 и Т4 ингибируют, а низкие стимулируют секрецию ТТГ.

При гипертиреозе синтез и секреция ТТГ в гипофизе по принципу обратной связи блокированы высокими уровнями Т3 и Т4: количество ТТГ в крови менее 0,2 мИЕ/мл или гормон в крови не определяются. Введение Т3 быстро снижает концентрацию ТТГ. Аналогичное действие оказывает и Т4, но для этого требуется доза в 10 раз больше, чем Т3, а торможение длится в 10 раз дольше.

  1.  
<< | >>
Источник:   И. П. Кондрахин.   Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник — М.: Колос,. — 520 с.. 2004

Еще по теме   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИРЕОТРОПИНА (ТТГ) В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DYAGNOSTIC SYSTEM LABORATORY, США)  :

  1.   9.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТРИЙОДТИРОНИНА (Т3) В СЫВОРОТКЕ ИЛИ ПЛАЗМЕ КРОВИ (DIAGNOSTIC SYSTEM LABORATORY, США) 
  2.   9.2.0ПРЕДЕЛЕНИЕТИР0КСИНА(Т4) в сыворотке КРОВИ (DIAGNOSTIC SYSTEM LABORATORY, США)  
  3.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕСТОСТЕРОНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DIAGNOSTICAUTOMATIONINC., США)  
  4.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНСУЛИНА В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (DIAGNOSTICSYSTEMLABORATORY, США)  
  5.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОРТИЗОЛА В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (DIAGNOSTICSYSTEMLABORATORY, США)  
  6.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАЛЬЦИТОНИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (DIAGNOSTICSYSTEMLABORATORY, США)  
  7.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОГЕСТЕРОНА В СЫВОРОТКЕ ИЛИ ПЛАЗМЕ КРОВИ (DIAGNOSTIC AUTOMATION INC., США)  
  8.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭСТРАДИОЛА В СЫВОРОТКЕ ИЛИ ПЛАЗМЕ КРОВИ (DIAGNOSTIC AUTOMATION INC., США)  
  9.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАРАТИРЕОИДНОГО ГОРМОНА (ПТГ) В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ (DIAGNOSTICSYSTEMLABORATORY, США)  
  10.   Определение витамина Е в сыворотке крови (см. с. 195). Определение церулоплазмина в сыворотке крови.  
  11.   Определение белковых фракций в сыворотке крови. 
  12.   Определение сиаловых кислот в сыворотке крови по реакции с резорцином. 
  13.   Определение общего белка в сыворотке крови рефрактометрическим методом.  
  14.   Определение белковых фракций в сыворотке крови турбидимет- рическим (нефелометрическим) методом.