<<
>>

  Определение восстановленного глутатиона в крови.  

  Принцип. Сульфгидрильная группа восстановленного глутатиона вступает в реакцию с 5,5-дитио-бис-(2-нитробензойной) кислотой (реактив Эллмана), в результате чего в эквимолярных количествах образуется окрашенный в желтый цвет тионитрофенильный анион (ТНФА), имеющий максимум поглощения при 412 нм.

Реактивы: 20%-ный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ);

0,3 моль/л фосфатный буфер, pH 8,0: 10,2 г КН7РО4 растворяют в 250 мл дистиллированной воды и 34,2 г К2НРО4 • ЗН20 — в 500 мл дистиллированной воды.

В раствор двузамещенного фосфорнокислого калия под контролем рН-метра приливают раствор однозамещенного фосфорнокислого калия до установления pH 8,0;
  1. моль/л раствор реактива Эллмана: 39,6 мг 5,5-ди- тио-бис-(2-нитробензойной) кислоты растворяют в 10 мл абсолютного метилового спирта.

Оборудование: спектрофотометр; центрифуга рефрижераторная; весы аналитические; холодильник бытовой; пипетки измерительные; пробирки центрифужные и химические.

Ход определения. В химические пробирки наливают по 0,5 мл гепаринизированной крови, 3,5 мл дистиллированной воды и хорошо перемешивают для лучшего гемолиза. Затем по 2 мл разведенной в 8 раз крови переносят в центрифужные пробирки и приливают к ним по 1 мл 20%-ного раствора ТХУ. Пробы тщательно перемешивают и оставляют в холодильнике на 15—20 мин. Затем их центрифугируют 15 мин при 3000 мин 1 и температуре 0—4 °С.

В две химические пробирки наливают по 0,5 мл фосфатного буфера и в каждую добавляют по 1 мл надосадочной жидкости. В опытную пробирку приливают 0,05 мл раствора Эллмана, а в контрольную — 0,05 мл метанола. Содержимое пробирок хорошо перемешивают. Измеряют оптическую плотность обеих проб против фосфатного буфера в 10-миллиметровой кювете при длине волны 412 нм.

Концентрацию восстановленного глутатиона рассчитывают по формуле

-              .72,6-Ю3,

13,1-Ю3

где С — содержание восстановленного глутатиона, ммоль/л; Е0 — оптическая плотность опытной пробы; Ек — оптическая плотность контрольной пробы; 13,1 • 103 — коэффициент малярной экстинкции ТНФА при 412 нм; 72,6 • 103 — фактор разведения.

Примечания. 1. Исследование крови необходимо проводить в максимально короткие сроки после ее взятия. 2. Реактив Эллмана следует приливать к буферу как можно быстрее после внесения в него надосадочной жидкости.

Клиническое значение. Глутатион представляет собой серосодержащий триплет, состоящий из трех аминокислот — глутаминовой, цистина и глицина. Содержится во всех живых организмах и играет важную роль в окислительно-восстановительных реакциях. В организме он присутствует главным образом в восстановленной форме (в-БН), тогда как на долю окисленной формы (в-БЗ-в) приходится 1—3 % общего его содержания. Глутатион — главный фонд мобильных сульфгидрильных групп, а также он участвует в транспорте аминокислот, обмене дисульфидов и поддержании сульфгидрильных групп белков в восстановленном состоянии. Как серосодержащее соединение глутатион участвует в реакции с гидропероксидами без участия каких-либо ферментов или катализаторов. Может ингибировать ПОЛ на уровне инициирования цепного процесса и способен реагировать со свободными радикалами так же активно, как а-токоферол.

Содержание восстановленного глутатиона в крови животных колеблется от 0,4 до 0,7 ммоль/л, в том числе у кур от 0,6 до 0,8 ммоль/л. На уровень глутатиона в крови влияет обеспеченность животных серосодержащими аминокислотами и серой. Его повышение в крови свидетельствует о выраженной защитной и детоксирую- щей силе организма.

Источники: 11, 17.

 

<< | >>
Источник:   И. П. Кондрахин.   Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник — М.: Колос,. — 520 с.. 2004

Еще по теме   Определение восстановленного глутатиона в крови.  :

  1.   Определение витамина Е в сыворотке крови (см. с. 195). Определение церулоплазмина в сыворотке крови.  
  2.   Определение активности глутатионредуктазы (КФ 1.6.4.2) в крови. 
  3. Конъюгация с глутатионом и цистеином. 
  4.   Определение общего рибофлавина в крови.  
  5.   Определение активности пероксидазы (КФ 1.11.1.7) в крови. 
  6.   Определение малонового диальдепща в крови.  
  7.   Определение белковых фракций в сыворотке крови. 
  8.   Определение витамина С в плазме крови.  
  9.   Определение марганца в крови перйодатным методом.  
  10.   Определение активности катал азы (КФ 1.11.1.6) в крови. 
  11.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЗЕРВНОЙ ЩЕЛОЧНОСТИ КРОВИ ДИФФУЗНЫМ МЕТОДОМ ПО И. П. КОНДРАХИНУ  
  12.   Метод неферментативного определения лактата и пирувата в одной пробе крови.  
  13.   Определение общего белка в сыворотке крови рефрактометрическим методом.  
  14.   Определение сиаловых кислот в сыворотке крови по реакции с резорцином. 
  15.   Определение железа в сыворотке крови по цветной реакции с сульфонированным (3-фенантролином.