<<
>>

З.З.6.З.              РАЗДЕЛЕНИЕ ЛИПИДОВ НА КЛАССЫ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ (ТСХ) 

 

                             Определение содержания отдельных классов липидов после их разделения методом ТСХ имеет ряд преимуществ перед описанным выше: во-первых, позволяет получить более точные данные, и, во-вторых, определение отдельных классов липидов можно автоматизировать и тем самым сократить время исследований.

П р и н ц и п.

В основе метода лежит адсорбционная хроматография, которая основана на сорбции растворенного вещества твердой фазой — активным сорбентом. Подвижная фаза (растворитель разделяемой смеси веществ) движется по неподвижной фазе (сорбенту), и при этом разделяемые компоненты перемещаются с различной скоростью в направлении движения растворителя. В качестве сорбента для разделения липидов и фосфолипидов чаще применяют силикагель — соединение с общей формулой 8Ю2 • пН20. Адсорбирующие свойства силикагеля объясняются наличием группы — 8ЮН—, имеющей свободные водородные связи. Присутствие моно- или мультимолекулярных слоев адсорбированной воды ухудшает разделяющие свойства силикагеля. Поэтому нагревание (активирование) пластинки с силикагелем при 100—115 °С для удаления воды повышает разделяющую способность силикагеля.

Метод ТСХ позволяет разделить сложные смеси липидов на классы: фосфолипиды, моно-, ди- и триацилглицерины, НЭЖК, холестерин свободный и этерифицированный; в свою очередь, фосфолипиды на подклассы, фосфатидилхолин (лецитин), фосфа- тидилэтаноламин и т. д. и тем самым упрощает и повышает точность количественного определения отдельных классов и подклассов липидов, а также их выделение для дальнейшего изучения.

Разделение общих липидов на классы методом ТСХ включает следующие операции: приготовление тонкого слоя силикагеля на стекле; активизация его, нанесение общих липидов на тонкий слой; разделение липидов в системе растворителей; проявление и идентификация отдельных классов липидов; их количественное определение.

Реактивы: силикагель для ТСХ с величиной частицы 10—40 мкм, приготовленный путем измельчения отечественного гранулированного силикагеля марки КСК, или силикагель марки ЛС 5/40 (Чехия), или аналогичных марок других фирм; петролейный эфир с точкой кипения 40—60 °С; диэтиловый эфир (лучше для наркоза) с точкой кипения 35—36 °С; уксусная кислота ледяная; хлороформ перегнанный; йод кристаллический;

  1. 10%-ный раствор фосфоромолибденовой кислоты или 10—15%-ный водный раствор серной кислоты;

свидетели—соединения отдельных классов липидов: фосфолипидов, триацилглицеридов, НЭЖК, холестерина свободного и эте- рифицированного.

В качестве таковых используют лецитин яичного желтка, трипальмитат или триолеат, пальмитиновую или другую жирную кислоту, холестерин и холестерин-эфир любой кислоты (3—5%-ной концентрации в хлороформе, ч. д. а.).

Оборудование (по Шталю): станок для фиксации пластинок, представляющий собой гладко выструганную доску длиной 100—120 см, шириной 20,7 см с гладкими бортиками по краям и высотой 1,5—2 см. В начале и конце станка также устанавливают бортики-ограничители. Перед работой плоскость станка покрывают на всю длину полиэтиленовой пленкой;

металлический аппликатор, позволяющий наносить слой силикагеля нужной толщины, который изготавливают из цельнометаллического прямоугольного бруска нержавеющей стали (он представляет собой как бы ящик без дна 19 * 5 см по внешним параметрам). Сверху с обеих торцевых сторон бруска оставляют специальные выступы для удобства его захвата при работе. Аппликатор плотно прилегает к поверхности стекла, но его задняя стенка имеет зазор (щель) высотой 3—5 мм, толщина которой регулируется закрепляющейся на винтах подвижной пластинкой (шторкой);

пластинки стеклянные 20 х 20 или любого другого размера; кассета для сушки и хранения готовых пластинок; стеклянная камера (прямоугольник или круглая) с притертой крышкой для хроматографии; сушильный шкаф; эксикатор; микропипетки на 0,1 мл и более; пульверизатор.

Ход определения. Приготовление тонкого слоя и нанесение липидов. Хорошо вымытые, обезжиренные стеклянные пластинки закладывают в станок. На старт и финиш станка кладу пластинки шириной не более 5—6 см. Все стекла еще раз протирают хлороформом. На старт помещают аппликатор с предварительно отрегулированной шириной зазора (250—300 мкм для разделения липидов на классы и 350—500 мкм для разделения фосфолипидов на подклассы), обращенного к переднему концу станка.

В коническую колбу вместимостью 150—200 мл отвешивают силикагель (из расчета 5 г на одну пластинку 20 х 20 см) и заливают двойным объемом дистиллированной воды, закрывают пробкой и энергично встряхивают 90 с до получения однородной массы (без пузырьков), затем быстро выливают в аппликатор и непрерывным плавным движением прибора наносят слой силикагеля на стеклянные пластинки.

Слой должен быть гладким, без пустот и наплывов.

Пластинки оставляют на ночь при комнатной температуре, а перед использованием их помещают в сушильный шкаф на 1—2 ч при 110 °С для активизации. После охлаждения пластинки с нижнего края ее на 0,3—0,5 см удаляют силикагель, а на 1—1,5 см выше иглой намечают линию старта.

Пробы липидов наносят (осторожно!) микропипеткой или микрошприцем с иглой в виде отдельного пятна или полосы шириной 1—1,5 см. Расстояние от краев стекла составляет 2 см, а между про

бами 2—3 см. Рядом с пробой наносят раствор каждого свидетеля в отдельности или их смесь.

Приготовление хроматографической камеры и подвижной фазы. Дно и внутренние стенки покрывают чистой фильтровальной бумагой и смачивают подвижной фазой, в которой будет проводиться разделение липидов. Это создает хорошее насыщение камеры парами подвижной фазы, что улучшает разделение. Подвижную фазу наливают в камеру в таком объеме, чтобы хорошо пропиталась фильтровальная бумага и на дне был слой толщиной

  1. 1,2 см. Камеру закрывают прошлифованной крышкой и ставят под вытяжной шкаф (все делается под вытяжным шкафом!).

В качестве подвижной фазы используют ряд смесей (табл. 24).

24. Состав подвижных фаз п соотношение в пих отдельных компонентов, объем/объем

Подвижные фазы

Компонент

После того как хроматографическая камера насытится парами подвижной системы (10—20 мин), в нее вносят пластинку с нанесенными липидами, которую ставят вертикально или с небольшим наклоном (около 60°) к стенке камеры. В прямоугольную камеру ставят 2 пластинки в виде буквы V. Камеру быстро закрывают и оставляют при комнатной или пониженной температуре на 40—45 мин. Как только граница подвижной фазы достигнет линии, расположенной на 1 см ниже верхнего края (финиша), пластинку быстро извлекают и в горизонтальном положении подсушивают 10—15 мин под вытяжным шкафом.

Для проявления липидов отдельных классов пластинки спрыскивают из пульверизатора водным раствором серной кислоты или спиртовым раствором фосфоромолибденовой кислоты и прогревают в сушильном шкафу при 180—200 °С до обугливания. Липиды разных классов выступают в виде черных пятен. В этих случаях липиды отдельных классов (кроме фосфолипидов) разрушаются. Чтобы обнаружить липиды без разрушения, чаще используют пары йода. Несколько кристалликов йода насыпают в стеклянный бюкс, вносят несколько капель спирта и помещают в эксикатор. После того как произойдет некоторая возгонка йода, в эксикатор вносят

пластинку силикагелем вниз и крышку плотно закрывают. Через 10—15 мин липиды выступают в виде ярко-желтых или коричневых пятен. Пластинку вынимают, пятна отводят иглой и после испарения йода (под вытяжным шкафом) их соскабливают и переносят в пробирки для количественного определения.

Анализ классов липидов можно проводить без экстракции растворителем в присутствии силикагеля, используя вышеизложенные химические методы исследования. Но перед определением оптической плотности содержимое пробирок центрифугируют для осаждения силикагеля. При необходимости экстрагировать липиды от силикагеля используют метанол для фосфолипидов и хлороформ для ацилглицеринов, НЭЖК и холестерина.

При использовании подвижных фаз 1 и 3 классы липидов располагаются в одной, а при использовании фазы 5 — несколько в другой последовательности (табл. 25).

25. Значение КГ для отдельных липидных классов прн нспользованнн разных недвижных фаз

Фазы 1 и 3

Фаза 5

Класс липидов

Липиды

Липиды

Липиды

сыворотки крови

печени

сыворотки крови

Фосфолипиды

0,00

0,00

0,00

Моноацилглицерины

0,04

0,02

Диацилглицерины

0,08

0,08

0,40

Холестерин свободный

0,11

0,12

0,21

НЭЖК

0,20

0,23

0,07

Триацилглицерины

0,44

0,42

0,63

Холестерин этерифициро- ванный

0,70

0,70

0,81

Для детектирования липидов отдельных классов на хроматографической пластинке в качестве свидетелей используют чистые препараты отдельных липидов. При отсутствии свидетелей можно пользоваться коэффициентом подвижности отдельных классов — ЯГ. Для его расчета замеряют общую длину разгонки на пластинке (от нижней до верхней границы), которую принимают за 100 %, а затем замеряют местоположение отдельных классов (по центру пятна), рассчитывают их прохождение в процентах относительно всей длины разгонки и сравнивают с литературными данными. На всех подвижных фазах фосфолипиды остаются на старте (на месте нанесения), а самым верхним классом являются эфиры холестерина.

Для разделения фосфолипидов на подклассы используют то же оборудование и тот же принцип приготовления тонкого слоя, как описано выше, но слой должен быть толще — 400—500 мкм. Это связано с тем, что для количественного определения индивидуальных фосфолипидов по фосфору необходимо наносить на пластину несколько больше липидов (5—10 мг).

В качестве подвижной фазы для разделения фосфолипидов методом одномерной хроматографии чаще всего используют подвижные системы, состав которых представлен в таблице 25а.

Концентрированный раствор липидов (5—10 %) наносят на пластину в виде полосы шириной 1,5—2 см или более. Разгон фосфолипидов занимает около 1 ч. После подсушивания пластины проводят детектирование и идентификацию отдельных подклассов фосфолипидов в парах йода или путем опрыскивания его 10%-ным раствором серной кислоты с последующим прогреванием в сушильном шкафу. Обугливание органической части молекулы отдельных фосфолипидов не влияет на количественное определение фосфора, выполняемое химическим путем.

Состав подвижных систем: хлороформ-метанол-вода, 65 : 25 : 4; хлороформ-метанол-32,5%-ный раствор аммиака, 70 : 30 : 5; хлороформ-метанол-вода, 70 : 30 : 5.

Идентификацию индивидуальных фосфолипидов проводят с помощью свидетелей или по величине Ш- в сопоставлении с литературными данными (табл. 25а).

25а. Значение величины Ы для фосфолипидов нри разделении их в разных системах

Подклассы

Подвижные системы

I

2

3

Фосфатидиловая кислота

0,87

Цереброзиды

0,64 (0,55)

0,79

Кардиолипин

0,77

0,55

0,84

Фосфатидилэтаноламин

0,52

0,45

0,58

Фосфатидилинозитол

0,40

0,11

0,20

Фосфатидилхолин

0,27

0,36

0,33

Фосфатидилсерин

0,21

0,06

0,10

Сфингомиелин

0,17

0,18

0,20

Лизолецитин

0,08

0,11

0,15

Старт

0,0

0,0

0,0

Значительную помощь в идентификации отдельных фосфолипидов оказывают специальные реакции. Так, фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин обнаруживаются после опрыскивания раствором нингидрида: 3 г нингидрида растворяют в 5 мл лутидина (2,6-диметилпиридин) и добавляют 95 мл н-бутанола, насыщенного водой. Появляется малиновая окраска, характерная для аминогрупп.

Фосфолипиды, содержащие холин (фосфатидилхолин, лизо- фосфатидилхолин и сфингомиелин), окрашиваются в оранжевый цвет реактивом Драгендорфа, который готовят из двух растворов: раствор I содержит 1,7 г 1И(Жgt;з)з • 5Н20 в 100 мл 20%-ного раствора уксусной кислоты; раствор II содержит 40 г К1 в 100 мл воды. Пластинки опрыскивают смесью, состоящей из 4 мл раствора I и

  1. мл раствора II с добавлением 20 мл воды.

Фосфатидилинозитол окрашивается в коричневый цвет аммиачным раствором серебра, который состоит из равных объемов

  1. 1 н. раствора ^N(gt;3 и 1 н. раствора ИНз-

Количество индивидуальных фосфолипидов после ТСХ определяют по содержанию в них фосфора по методике, описанной выше для фосфолипидов.

Поскольку фосфолипиды разных подклассов содержат неодинаковое количество фосфора, их соотношение в исследуемых материалах выражают в мкг (мг) или в процентах неорганического фосфора по отношению к его содержанию в общих фосфолипидах.

  1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КЛАССОВ ЛИПИДОВ ИНСТРУМЕНТАЛЬНЫМ МЕТОДОМ

Принцип. В основе метода лежит фотометрия плотности окраски отдельных классов липидов, разделенных методом ТСХ, в отраженном или проходящем свете.

Реактивы: пластинки «Силуфол», ЦУ-254 (Чехия) для качественного анализа методом ТСХ размером 150 х 150 мм; стеклянные пластинки размером 200 х 200 мм; подвижная фаза: петролейный эфир диэтиловый, эфируксусная кислота (85 : 15 : 1);

стандартная смесь липидов в хлороформ-метаноловой смеси (2:1) (табл. 26);

26. Примерный состав стандартной смеси липидов, %

Класс

Источник липидов

Смесь, предназначенная для

липидов

животных

птиц

Фосфолипи

ды

Лецитин синтетический или выделенный методом ТСХ из яичного желтка

30-40

50-60

Холестерин

Холестерин синтетический (ч. д. а.)

3-6

1,5-3

НЭЖК

Пальмитиновая, стеариновая или олеиновая кислота, или их смесь (ч. д. а.)

3-5

0,3-1

Триацилгли-

церины

Триолеин (ч. д. а.)

10-15

30-40

Холесте

рин-эфир

Холестерин-пальмитат или хо- лестерин-олеат (ч. д. а.)

30-35

1,5-3

  1. 5%-ный раствор фосфорномолибденовой кислоты в этаноле (свежеприготовленный).

Оборудование: денситометр — интегратор или сканиметр (отечественного или зарубежного производства); микрошприц на

  1. 5              (10) мкл; пульверизатор плюс все оборудование, используемое для разделения липидов методом ТСХ.

Ход определения. На пластинку «Силуфол» (после ее активизации в термостате при 100—105 °С в течение 3—5 мин) наносят микрошприцем не более 6 проб липидов (по 0,06—0,1 мг) в виде тонкой полосы шириной 8—10 мм (если используют стеклянные пластинки с более толстым слоем, то можно нанести 8—9 проб липидов по 0,2—0,3 мг и более). Пластинку опускают в камеру и после разгонки извлекают, подсушивают в горизонтальном положении, осторожно опрыскивают спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты и прогревают в сушильном шкафу при 90—100 °С до появления четко выраженных пятен сине-голубого цвета (1—2 мин).

Запись фракций липидов проводят в день их разделения (при хранении обесцвечиваются). Для этого пластинку «Силуфол» разрезают ножницами по числу нанесенных проб (но не шире 4 см), вкладывают в кассету денситометра и записывают при красном светофильтре в отраженном свете. Каждый класс липидов на хроматограмме выписывается в виде пика. Порядок расположения пиков тот же, что и на стеклянных пластинках. При разделении липидов сыворотки крови коров триацилглицерины нередко дают

  1. 3              следующих друг за другом пятна (пика).

Расчет. Относительную величину липидов отдельных классов рассчитывают по величине пиков. Для этого сначала определяют абсолютную площадь пиков путем умножения его высоты[1] на ширину на половине высоты от базисной линии. Полученные величины разных пиков суммируют и принимают за 100 %, а затем находят процентную долю каждого пика.

Полученные данные, как правило, не отражают действительную величину липидов соответствующего класса. Поэтому для каждого класса следует найти свой поправочный коэффициент. Для этого готовят стандартный раствор — смесь липидов определяемых классов (см. табл. 26) в хлороформ-метаноловой смеси. Небольшое количество смеси упаривают до концентрации 1—3 %, с помощью микрошприца наносят на пластинку в 8—10 повторностях и разгоняют при тех же условиях, как описано выше. После окраски пики записывают на денситометре и высчитывают относительную площадь каждого пика. Затем процентное содержание отдельного класса стандартной смеси делят на процентное содержание соответствующего класса, найденного после

Класс липидов

Содержание, %

А/Б

Величина коэф фициента

А*

Б**

Фосфолипиды

40

6,75

40/6,75

5,92

Холестерин свободный

6

24,0

6/24,0

0,25

НЭЖК

5

5,81

5/5,81

0,86

Триацилглицерины

40

44,9

40/44,9

0,89

Холестерин-эфир

9

12,5

9/12,5

0,72

* А — содержание класса в стандартной смеси. ** Б — фактически обнаруженное содержание.

Реактивы: инертные носители неподвижной фазы для хроматографической колонки: хромосорбы XV, Р, в и Т, хромотон N. целит 545 и др. с величиной частиц 40/60, 60/80, 80/100 и 100/120 меш;

жидкие фазы, полярные и неполярные, которые должны обладать следующими свойствами (табл. 28);

28. Свойства жидких фаз

Жидкая фаза

Максимальная рабочая температура, ’С

Растворитель

Диэтиленгликольсукцинат

(полярная)

190

Ацетон

Диэтиленгликольадипат

(полярная)

190

Хлороформ

Полиэтиленгликольсукцинат

(полярная)

200

Хлороформ, ацетон

Полиэтиленгликольадипат

200

Ацетон, хлороформ

Апиезон Б (неполярная)

300

Хлороформ

ацетон; хлороформ; гексан; бензол; диэтиловый эфир; соляная кислота (ч. д. а.); метанол; петролейный эфир; безводная смесь N82804 и N811003 (2 : 1); стандартная смесь метиловых эфиров жирных кислот; метилирующая смесь: 0,5 н. раствор натрия мети- лата (СНзО№), или 0,3 н. хлористый водород в абсолютном метаноле, или 0,3%-ный раствор серной кислоты (Н^О^ в абсолютном метаноле.

Оборудование: газожидкостный хроматограф отечественного или зарубежного производства. Прибор состоит из: а) хроматографической колонки (металлической или стеклянной), содержащей неподвижную фазу, в которой на входе располагается камера ввода анализируемого материала, а на выходе — детектор; б) термостатической камеры, обеспечивающей стабильную заданную температуру для хроматографической колонки; в) самописца;

г)              баллонов с газом-носителем, водородом и воздухом (для горючей смеси);

микрошприцы (марки Гамельтона) отечественного или зарубежного производства для введения анализируемого материала в камеру — испаритель хроматографа; запасные хроматографические колонки; расходометр — для определения скорости поступления газа-носителя, водорода, воздуха; силиконовые прокладки для герметизации колонок; пробирки с притертыми пробками на 10 мл; пипетки на 1, 2, 5 и 10 мл; пипетки бактериологические; груша резиновая (малая); стеклянные ампулы на 10 и 15 мл; колба Бунзена.

Ход определения. После установки и наладки всех (электронных и механических) систем прибора, что выполняется специально подготовленными инженерами, его подготавливают к работе в соответствии с целью и задачами исследований. В подготовительную работу входит: подготовка хроматографической колонки; выбор режима работы прибора и подготовка метиловых эфиров жирных кислот для их разделения.

Подготовка колонки. Эффективность разделения эфиров жирных кислот в значительной степени определяется качеством подготовки хроматографической колонки: ее внутренним диаметром, длиной и качеством набивки (носителем и жидкой фазой). Чаще всего используют металлические колонки (они надежнее стеклянных) с внутренним диаметром 3—5 мм и длиной от 1 до 3 м. Предварительно колонка должна быть тщательно промыта и высушена. Для промывки применяют чистые, профильтрованные реагенты в следующем порядке:

  1. 1%-ный раствор поверхностно-активных веществ типа ОП-7, ОП-Ю, ТВИН-60 или ТВИН-80 в дистиллированной воде (трехкратно);
  2. дистиллированную воду (трехкратно);
  3. ацетон или метанол (двукратно);
  4. бензол (двукратно);
  5. диэтиловый спирт (двукратно);
  6. растворитель, в котором будет растворяться неподвижная жидкая фаза (трехкратно).

После этого колонку продувают азотом и помещают в сушильный шкаф при температуре 70—80 'С на 1 ч.

Готовят наполнитель для колонки. Для этого подбирают соответствующую жидкую фазу и 5—15 % ее наносят на выбранный инертный носитель. Необходимое количество жидкой фазы (например, 10 г), растворенной в соответствующем растворителе (хлороформ или ацетон), вносят в круглодонную колбу со шлифом и туда же добавляют определенное количество (например, 100 г) твердого носителя. Колбу присоединяют к роторному испарителю и при вращении выпаривают растворитель полностью. Инертный носитель, пропитанный жидкой фазой, раскладывают тонким слоем на фильтровальной бумаге и подсушивают под вытяжным шкафом, а затем в термостате при 80—100 °С до хорошо выраженной сыпучести. В таком виде наполнитель готов для использования.

Колонку заполняют следующим образом. Один конец закрывают стеклянной ватой (на глубину 0,7—1,5 см) и присоединяют к вакуумному насосу, а к другому присоединяют воронку (через резиновую трубку). Наполнитель засыпают через воронку при постоянном постукивании палочкой до тех пор, пока колонка не заполнится полностью, после чего открытый конец закрывают стеклянной ватой. Наполнитель должен заполнить колонку достаточно плотно, без пустот. Для его уплотнения колонку можно присоединить к баллону с азотом и на 1—2 мин пустить с напором газ, постоянно постукивая палочкой.

После этого колонку вставляют в хроматограф и подвергают «тренировке», которая сводится к прогреванию ее в течение 15—20 ч при температуре несколько более высокой, чем та, при которой она будет работать, но ниже допустимой для данной жидкой фазы. В противном случае последняя улетучивается. Во время прогревания колонки через нее пропускают слабый поток газа-носителя (5—10 мл/мин). При этом второй конец колонки, обращенный к детектору, не присоединяют, чтобы исключить загрязнение последнего.

После завершения «тренировки» колонки нагреватель термостата выключают, охлаждают до комнатной температуры, не выключая газа-носителя, что предупреждает конденсацию влаги внутри колонки при охлаждении. Затем колонку присоединяют к детектору, прибор включают и выводят на рабочий режим, на котором предусматривается разделение метиловых эфиров жирных кислот. В рабочий режим прибора входят следующие параметры: температура, скорость подачи газа-носителя, водорода и воздуха. От правильной установки и поддержания режима работы зависит качество разделения жирных кислот.

Выбор режима работы прибора. Для каждой марки хроматографа устанавливают свой режим, но чаще всего такой: температура колонки 160—190 °С, испарителя 220—240 °С, поток газов: носителя — 30— 75 мл/мин, водорода — 40—60 и воздуха — 300—400 мл/мин. Для стабилизации режима работы прибор включают и прогревают при заданной температуре 1,5—2 ч. До прогревания прибора следует убедиться, что в газовой системе нет утечки газов. Для этого все контакты колонки с баллонами и прибором смазывают мыльной пеной. После прогревания нужно убедиться в стабильности температуры термостата и базисной линии самописцев. С этой целью в колонку 2—3 раза вводят микродозы (1—3 мкл) хлороформа или гексана, для чего пользуются специальными микрошприцами вместимостью от 1 до 10 мкл.

Приготовление метиловых эфиров жирных кислот. Поскольку жирные кислоты нелетучие соединения, их перед введением в хроматограф следует перевести в летучие — метиловые эфиры. Приводим два наиболее удобных и быстро выполнимых способа метилирования жирных кислот.

  1. Липидный экстракт в дозе, соответствующей 5—20 мг чистых липидов, вносят в пробирку с притертой пробкой и выпаривают растворитель струей азота. В пробирку добавляют 2 мл 0,5 моль/л натрия метилата, закрывают и оставляют стоять при комнатной температуре 30—40 мин или подогревают на песочной бане до 50—55 °С. Реакцию останавливают добавлением 0,2 мл 6 моль/л раствора НС1.

Затем в пробирку вносят 4 мл петролейного эфира и 4 мл дистиллированной воды, закрывают и содержимое энергично встряхивают, дают отстояться и с помощью бактериологической пипетки с резиновой грушей верхний петролейный слой переносят в пенициллиновый флакон с сульфат-карбонатной смесью и сушат

  1. мин. После этого петролейный эфир и растворенные в нем метиловые эфиры переносят в короткую пробирку с притертой пробкой, петролейный эфир удаляют струей азота, а оставшиеся метиловые эфиры растворяют в 2—3 каплях хлороформа, гексана, сероуглерода или в другом подходящем растворителе и с помощью шприца вводят в хроматограф (0,5—1 мкл).

  1. В ампулу вносят 5—20 мг липидов, раствор испаряют струей азота и добавляют 2 мл метилирующей смеси (0,3 н. раствор хлористого водорода или 3%-ный раствор серной кислоты в абсолютном метаноле). Ампулу запаивают на газовой горелке и помещают в термостат на 1—2 ч при температуре 105 °С. После охлаждения содержимое ампулы небольшими порциями переносят на бумажный фильтр и быстро просушивают под феном. Затем фильтр сгибают на угол и метиловые эфиры осторожно смывают гексаном (5—6 мл) в пробирку. Гексан удаляют струей азота (при 45—50 °С) до минимума, а сконцентрированные метиловые эфиры (соломенного цвета) используют для анализа.

Примечания. Метилирующие смеси в лабораторных условиях готовят следующим образом:

  1. для приготовления 0,5 моль/л раствора натрия ме- тилата (CH3CONa) осторожно растворяют 2,299 г металлического натрия в 100 мл абсолютного метанола;
  2. для приготовления 3%-ного раствора серной кислоты 1,63 мл H2SO4 (ч. д. а.) растворяют в 100 мл абсолютного метанола;
  3. для приготовления 0,3 н. хлористого водорода поступают следующим образом. В колбу Бунзена на 0,5 или 1 л вносят 200—250 г натрия хлорида (NaCl), закрывают ее корковой или резиновой пробкой с отверстием, в которое вставляют делительную воронку на 200 мл, наполненную концентрированной серной кислотой (100—150 мл). По мере вливания (по каплям) кислоты в колбу с натрия хлоридом происходит реакция с выделением газообразного хлористого водорода, который через резиновый шланг, надетый на боковой отросток колбы и заканчивающийся стеклянной пипеткой, отводят во флакон с метанолом (через резиновую пробку), насыщая его до указанной выше концентрации. По завершении реакции в колбочку отбирают 10—15 мл метанола, вносят 1—2 капли индикатора Ташира и титруют 0,1 н. раствором NaOH для определения концентрации НС1;
  4. если метиловые эфиры или липиды требуют хранения, то их следует продуть азотом, ампулы запаять, а пробирки закрыть пробками и залить парафином. Поместить в герметически закрывающуюся емкость и хранить в холодильнике;
  5. если ставится цель изучить жирнокислотный состав отдельных классов липидов (фосфолипидов, триацилглицеринов, НЭЖК, эфиров холестерина) или подклассов фосфолипидов, то предварительно их разделяют методом ТСХ на стеклянной пластинке (для количественного анализа). Экстрагируют определенным растворителем и метилируют любым указанным выше способом.

Разделение, идентификация жирных кислот и расчет площади их пиков. Пробу метиловых эфиров жирных кислот вводят в колонку специальным микрошприцем через самоуплотняющуюся резиновую мембрану инжектора путем быстрого нажатия на поршень. Если предусматривается получить только процентное соотношение жирных кислот в пробе, то точность объема вводимой пробы не имеет значения (однако он должен быть оптимальным). При калибровке прибора объем пробы должен быть точно измерен.

Как указывалось выше, смесь метиловых эфиров, проходя по колонке с газом-носителем, селективно удерживается жидкой фазой и распределяется в колонке по мере увеличения длины их углеродной цепи. Выходя из колонки, метиловые эфиры отдельных жирных кислот попадают в детектор и изменяют в нем электропроводность.

В настоящее время в лабораторной практике наибольшее применение получили газожидкостные хроматографы с пламенно-ионизационными детекторами и детекторами по теплопроводности (катарометрами).

Принцип работы ионизационных детекторов основан на том, что электропроводность газа прямо пропорциональна концентрации в нем заряженных частиц. Жирная кислота, выходящая из колонки в виде газа, смешивается с водородом и сжигается в атмосфере воздуха или кислорода. Ионы и электроны, образованные в пламени, попадают в межэлектродное пространство, уменьшают его сопротивление, в результате чего во внешней цепи возникает ток (электросигнал). Последний через усилитель регистрируется самописцем в виде соответствующих пиков.

Пламенно-ионизационный детектор чувствителен фактически ко всем соединениям, за исключением Не, Ат, Кг, Ne, Хе, 02, CS2, COS, SiHCl3, SiF4, H2S, S02, NO, N20, N02, NH3, CO, C02, H20, SiC^.

Принцип работы детектора по теплопроводности основан на том, что нагретое тело теряет тепло со скоростью, зависящей от состава окружающего газа, поэтому скорость теплоотдачи используется здесь для определения состава газа. Основным элементом катарометра служит металлическая нить, скрученная в спираль и расположенная внутри камеры в металлическом блоке. Нить нагревают, пропуская через нее постоянный ток. Температура нити определяется равновесием, устанавливающимся между входной электрической мощностью (I R) и мощностью тепловых потерь, связанных с отводом тепла окружающим газом. При пропускании через детектор чистого газа-носителя потеря тепла постоянная, поэтому температура нити также постоянная. При наличии в газе-носителе анализируемого вещества температура нити изменяется, что вызывает соответствующее изменение электрического сопротивления, передающегося на самописец.

Пламенно-ионизационный детектор во много раз чувствительнее катарометра.

В тех случаях, когда проба анализируемого вещества растворена в хлороформе или гексане, через несколько секунд после ее введения в колонку сигнал детектора от растворителя регистрируется резким сдвигом пера самописца, а после ее выведения возвращается обратно до или почти до базисной линии. Если в качестве растворителя используется сероуглерод, то сигнал не регистрируется.

Через несколько секунд или минут самописец начинает записывать сигналы, обусловленные выходом метиловых эфиров жирных кислот, начиная с самых коротких (6 : 0, 8 : 0, 10 : 0) и кончая самыми длинными (20 : 4, 22 : 0 и т. д.).

При разделении жирных кислот на полярных жидких фазах сначала выходят насыщенные, затем ненасыщенные, а на неполярных фазах, наоборот, сначала выходят ненасыщенные, а затем насыщенные жирные кислоты.

Время от момента введения пробы в колонку до момента выхода той или иной кислоты называется временем относительного удерживания. Установлено, что время относительного удерживания очередной кислоты по сравнению с предыдущей увеличивается на величину, равную 1,56. Величины времени удерживания используются для идентификации пиков.

Некоторые жирные кислоты имеют близкое время относительного удерживания, однако у каждой из них только одно определенное время удерживания, не зависящее от присутствия других компонентов.

При соблюдении режима работы хроматографа (температура и скорость потока газов) воспроизводимость времени удерживания может составлять 99—100 %.

Данные по относительному времени удерживания метиловых эфиров жирных кислот на полярной и неполярных фазах при разных температурах приведены в таблице 29. От полярности фазы в значительной степени зависит качество разделения анализируемых смесей жирных кислот.

29. Относительное время удерживания метиловых эфиров жирных кислот на полярной н неполярных фазах (по литературным данным)

Кислота

Код*

Относительное время удерживания

Полярная

фаза

Неполярные фазы

полиэтиленгликоль- адипат (/ = 180 "С)

полиэтиленгликоль- сукцинат (/ = 200 ’С)

апиезон Ь (/= 197 "С)

Каприловая

8 : 0

0,060

0,096

0,030

Пеларгоновая

9 : 0

0,082

0,136

0,047

Каприновая

10 : 0

0,134

0,181

0,073

Ундекановая

11 : 0

0,183

0,237

0,117

Лауриновая

12 : 0

0,261

0,322

0,180

Кислота

Код*

Относительное время удерживания

Полярная

фаза

Неполярные фазы

полиэтиленгликоль- адипат (7 = 180 "С)

полиэтиленгликоль- сукцинат (/ = 200 ”С)

апиезон Ь (/= 197 "С)

Тридекановая

13:0

0,362

0,412

0,250

изо

13:0

0,373

Миристиновая

14:0

0,510

0,565

0,420

изо

14:0

0,497

Миристолеиновая

14:1

0,600

Пентадекановая

15:0

0,705

0,704

0,66

изо

15:0

0,689

антеизо

15:0

0,689

0,68

Пальмитиновая

16:0

1,00

1,00

1,00

Пальмитолеиновая

16:1

1,15

0,90

Гептадекановая

17:0

1,40

1,29

1,51

Гептадеценовая

17:1

1,62

1,31

Стеариновая

18:0

1,97

1,75

2,36

Олеиновая

18:1

2,20

2,00

2,03

Линолевая

18:2

2,65

2,45

Линоленовая

18:3

3,25

3,16

Нондекановая

19:0

2,90

2,27

Арахиновая

20:0

3,87

3,11

5,80

Эйкозаеновая

20:1

4,44

Эйкозадиеновая

20:2

4,81

Эйкозатриеновая

20:3

5,30

3,65

Арахидоновая

20:4

6,56

5,44

3,48

Бегеновая

22:0

7,90

* Первые цифры означают количество атомов углерода в цепи, 0 — отсутствие двойных связей, 1, 2, 3 и 4 — количество двойных связей в молекуле жирной кислоты.

Для разделения метиловых эфиров жирных кислот, полярных соединений (фосфолипидов, свободных жирных кислот, холестерина, сфингомиелинов, а также жирных кислот общих липидов) обычно используют полярные фазы, а для разделения неполярных соединений (триацилглицеринов) — неполярные.

В зависимости от длины колонки, скорости потока газа-носителя и рабочей температуры время разделения смеси эфиров жирных кислот занимает от 40 до 60—70 мин. Чем короче колонка, выше температура и скорость потока газа-носителя, тем меньше время анализа. Однако при уменьшении длины колонки и повышении скорости газа-носителя разделение отдельных жирных кислот резко ухудшается. Поэтому длина колонки, скорость потока газа и температура должны быть оптимальными, что определяется качеством разделения. Чаще всего используют колонки длиной 1,5—2,5 м.

Идентификацию пиков жирных кислот на хроматограммах лучше всего проводить по стандартным смесям химически чистых метиловых эфиров жирных кислот. При этом следует начинать запись с простых смесей, содержащих 2—3, а затем 4—5 и больше жирных кислот, увеличивая их набор до максимума.

При отсутствии набора метиловых эфиров жирных кислот идентификацию проводят с помощью относительного времени удерживания отдельных жирных кислот, исходя из литературных данных (см. табл. 29).

Конечный результат разделения проб — определение абсолютного и относительного содержания в них отдельных жирных кислот. Оба эти расчета делают на основе установления площади того или другого пика, а также суммы площадей всех пиков. Поэтому правильное определение площади пика крайне важно. Существует несколько способов их вычисления на хроматограмме: 1) умножением высоты пика на ширину на половине его высоты (в мм);

  1. вырезанием пиков и взвешиванием их (бумаги) на аналитических весах; 3) путем умножения высоты пика (мм) на относительное время удерживания кислоты в колонке хроматографа.

Наиболее признанным стал последний способ. За высоту пика с округлой вершиной берут точку пересечения двух линий, проведенных от базисной линии касательно боковых сторон пика. Полученную высоту (мм) умножают на время удерживания данного пика, которое определяется по расстоянию (мм) от момента введения пробы (первая реакция самописца) до центра (или верхушки) пика. Метод прост и дает точные результаты. Затем рассчитанные площади пиков суммируют (100 %) и рассчитывают долю (%) каждого пика (кислоты). При этом следует внести поправку на чувствительность детектора.

Первые пики, выходящие на самописце, обычно записывают на самой высокой чувствительности (это кислоты от 6 : 0 до 16 : 1— 17 : 1). Затем чувствительность загрубляют 2—8 раза (все зависит от концентрации метиловых эфиров и характера пробы) до выхода наиболее больших по размеру пиков (от 18 : 0 до 18 : 2). Затем чувствительность вновь повышают до максимума и на ней заканчивают запись остальных жирных кислот (от 18 : 3 до 20 : 4—22 : 0) (см. табл. 29). Если проводится анализ жирных кислот в липидах морских рыб, то после бегеновой кислоты (22 : 0) выходят 22 : 1, 22 : 5, 22 : 6, т. е. эруковая, докозапентаеновая и декозагексаеновая кислоты соответственно.

Поэтому нельзя отключать самописец ранее чем через 50—60 мин, а иногда выжидают и больше. Исследователь должен быть уверен, что все метиловые эфиры из анализируемой пробы вышли из колонки. Иначе колонка будет загрязняться и ухудшит разделение жирных кислот.

Если необходимо определить абсолютное количество жирных кислот, содержащихся в анализируемой пробе, то полученную площадь каждого пика умножают на поправочный коэффициент. Для этих целей готовят растворы жирных кислот известной концентрации (например, 5—10 мг/мл) в гексане или хлороформе и известное (точно!) количество вводят в колонку. После неоднократного повторения выводят среднюю величину площади пика той или иной кислоты. Такие средние величины, полученные для разных доз, позволяют вывести графическую зависимость площади пика от дозы кислоты (табл. 30).

30. Пример расчета поправочного коэффициента

Код кислоты

Д мкг

П, мм2

П/В

К

16: 0

10

400

40

1,000

18: 0

10

540

54

1,350

18: 1

10

600

60

1,500

18: 2

10

390

39

0,975

18: 3

10

310

31

0,775

Для того чтобы рассчитать поправочный коэффициент (К), первоначально находят отношение площади пика (Л) к массе вещества (В) — П/В. Затем полученную для каждого пика величину рассчитывают относительно этой же величины определенной жирной кислоты, чаще всего пальмитиновой, поправочный коэффициент которой берут за 1,0.

Источники: 6, 72.

  1.  
<< | >>
Источник:   И. П. Кондрахин.   Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник — М.: Колос,. — 520 с.. 2004

Еще по теме З.З.6.З.              РАЗДЕЛЕНИЕ ЛИПИДОВ НА КЛАССЫ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ (ТСХ) :

  1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КЛАССОВ ЛИПИДОВ ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ  
  2.   Определение алкалоццов методом ТСХ (по В. М. Серову, В. А. Волковой, 1979) 
  3.   Определение токоферолов в тканях и сыворотке крови методом колоночной хроматографии. 
  4.   Метод экстракции липидов спиртово-эфирной смесью (по Блюру).  
  5. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОДУКТОВ ПЕРЕКИСНОГО (СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО) ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ  
  6. Гидравлические способы разделения
  7. КЛАСС КОСТНЫЕ РЫБЫ — OSTEICHTHYES Характеристика класса и система
  8. Разделение навоза на твердую и жидкую фракции
  9. Взаимодействие токсикантов с липидами. 
  10.   Определение дезоксиниваленола в зерне с применением обращен- но-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии.  
  11. РАЗДЕЛЕНИЕ ЖИВОГО ПОКРОВА ЗЕМЛИ НА СООБЩЕСТВА [23]
  12. Методы профилактики развития резистентности паразитов к препаратам Биологические методы.
  13. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ ЛИПИДНОГО ОБМЕНА  
  14. КЛАСС ГОЛОВОНОГИ
  15. ВИДЫ И КЛАССЫ
  16. КЛАСС КРУГЛОРОТЫЕ — CYCLOSTOMATA