<<
>>

ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ

Источники и пути передачи инфекции. Источник инфекции - больные животные и латентные вирусоносители. Особенно опасны быки-производители. Восприимчивые животные обычно заболевают через 10-15 сут после поступления в неблагополучное хозяйство.
Установлена возможность контактного, интраназального, воздушно-капельного заражения животных, а также через инфицированные корма, транспортные средства, работников животноводства, птиц, насекомых и т.д. Особенно опасна абортивная форма болезни, так как она трудно выявляется и может быть причиной эпизоотий (6, 8).

Предполагают, что в странах Африки антилопа гну является латентным носителем вируса ИРТ. Помимо того, вирус может реплицироваться в клещах, которые играют важную роль в возникновении заболевания среди КРС. ДИАГНОСТИКА

ИРТ диагностируют на основании клинико-эпизоотологических данных, патологоанатомических изменений в органах и тканях с обязательным подтверждением лабораторньми методами. Латентную инфекцию устанавливают только лабораторньми исследованиями. Лабораторная диагностика включает: 1) выделение вируса из патологического материала в культуре клеток и его идентификацию в PH или РИФ; 2) обнаружение АГ вируса ИРТ в патологическом материале с помощью РИФ; 3) выявление АТ в сыворотке крови больных и переболевших животных (ретроспективная диагностика) в PH или РНГ А. Для лабораторной диагностики ИРТ используют набор диагностикумов ИРТ КРС и набор эритроцитарного ди- агн ости кума для серодиагностики инфекции в РНГ А.

Диагностику ИРТ проводят параллельно с исследованием материала на ПГ-3, аденовирусную (1 и 2), PC-инфекции и ВД-БС. Схема проведения лабораторной диагностики ИРТ аналогична применяемой при диагностике аденовирусной инфекции. Предварительный диагноз на ИРТ КРС ставят на основании положительных результатов обнаружения АГ в патологическом материале РИФ с учетом эпизоотологических и клинических данных, а также патологических изменений.

Окончательный диагноз ставят на основании совпадения результатов РИФ с выделением и идентификацией вируса; совпадение результатов РИФ с обнаружением АТ в 30% и более вторых проб сывороток в титрах не ниже 1:2 в PH и 1:26 в РНГ А и обнаружением 4-кратного и более увеличения титра АТ в парных пробах сывороток. Предварительный диагноз ставят в ветеринарных лабораториях в течение 2-3 дн, окончательный - в течение 15-30 ди.

Выделить вирус из носовой полости, влагалища и с конъюнктивы удается с 5-го по 10-й дн, а ВНА - с 5-8-го дня после заражения. Более высокий титр АТ наблюдается после 35 дн, затем начинается медленное снижение. Для выделения вируса ИРТ из бразильской спермы использовали 2 линии перевиваемых клеток МДВК и метод непрямой ИФ (67). Установлено, что максимальное количество вируса выделяется во время подъема температуры тела на 4-

7-й дн болезни и продолжался до 10-14 дн (8).

Индикация вируса

Обнаружение специфических телец-включений. В ядрах клеток эпителия пораженных слизистых оболочек носовой полости, вульвы, вагины и конъюнктивы находят специфические тельца-включения. Через 18-20 ч после заражения их можно обнаружить в клетках культуры, окрашенной гематоксилин-эозином.

Выделение вируса. Вирус выделяют в культурах клеток почек телят, почек эмбрионов телят, тестикул бычков. В настоящее время для выделения вируса ИРТ используют 2 линии клеток МДВК. Эти клетки активно синхронизируются ловастатином (лекарство для лечения гиперхолинестерии у людей). У синхронизированных клеток экспрессия генов ГВ-1 КРС не зависит от фазы клеточного роста (70). В этой линии клеток выделяли вирус из бразильской коммерческой спермы с признаками ЦПЭ и подтверждением методом прямой ИФ (67).

Экспресс-методы индикации. В ранее опубликованных работах (72, 73) для обнаружения вируса ИРТ применен метод молекулярной гибридизации с использованием радиоактивно меченых ДНК-зондов. Однако более перспективным является применение нерадиоактивного метода детекции вирусной ДНК.

Описаны выявленные последовательности BHV-1 гибридизацией in situ с помощью меченного биотином ДНК-зонда, сконструированного путем клонирования Hind-III фрагмента вирусного генома в плазмиду (74). Предложенный зонд также имел существенный недостаток, поскольку неспецифически связывался с ДНК вируса БА. Поэтому разработан нерадиоактивный метод детекции вируса ИРТ на основе высокочувствительного зонда, меченного биотином. Время тестирования биотинилирован- ного зонда составляет около суток, что существенно меньше по сравнению с вирусологическим тестированием (до 40 дн). Наиболее важным представляется использование биотини- лированного ДНК-зонда в случае выявления вируса в период карантинирования вновь завезенных животных, а также для обнаружения заболевания на ранних стадиях и диагностики латентной формы ИРТ для выявления возможного содержания вируса ИРТ в сперме быков (71). Разработана также ПЦР для обнаружения герпесвируса типа 1 КРС, PC-вируса КРС и пестивирусов (71). ПЦР на основе праймеров из гена gl вируса КРС позволяет обнаруживать 3 пг чистой вирусной ДНК, 0,1-1,0 ТЦД50/МЛ или единственную зараженную клетку. Вирус ИРТ успешно выявляли в назальных смывах зараженных телят, сыворотке и сперме (68).

Серологическая идентификация

ИФ. Техника постановки её такая же, как и при диагностике аденовирусной инфекции КРС. Обращают внимание на свечение АГ в цитоплазме и перинуклеарной зоне неповрежденных клеток. Ярко-зеленая флюоресценция в виде гранул или диффузного свечения цитоплазмы не менее чем в 10% клеток позволяет оценить препарат как положительный. Предварительный диагноз ставят при наличии не менее 30% положительных препаратов от общего количества исследованных проб. В мазках из влагалища и конъюнктивы специфическую флюоресценцию отмечали через 24 ч, из препуция - через 48, из носа и трахеи - через 72 ч после заражения. Присутствие специфического АГ удается подтвердить заражением культуры клеток почки телят, в которой обнаруживается специфическая перинуклеарная и диффузная цитоплазматическая флюоресценция, свойственная ИРТ. Использование культуры клеток почки кролика позволяет освободиться от неспецифического свечения.

Совпадаемость результатов ИФ и патологоанатомических изменений составляет 87%, а ИФ н вирусологических исследований - 44%. При параллельном исследовании сывороток в PH и РНГ А результаты совпадали в 94% случаев. В полевых условиях РИФ оказалась положительной в 18,5%, а метод вирусовыделения - в 15,9% случаев. РИФ можно использовать для экспресс-диагностики ИРТ с последующим подтверждением диагноза вирусологическими методами (6, 8).

PH. При наличии ЦПД в культурах клеток, зараженных изолятом, и положительной ИФ проводят окончательное типирование вируса в PH, которую ставят общепринятым методом в первичной культуре ПЭК или перевиваемой линии клеток МДВК. Результаты PH учитывают по ЦПД вируса, для чего определяют титр типируемого изолята в присутствии специфической и отрицательной контрольной сывороток. Титр рассчитывают по методу Рида и Менча и выражают в ТЦД50/МЛ. Затем вычисляют индекс нейтрализации. Видовую принадлежность изолята устанавливают при разности в титрах вируса не менее 2 lg; при разности нейтрализации от 1 до 2 реакцию считают сомнительной, в этом случае её повторяют; при разности нейтрализации менее 1 реакцию считают отрицательной. При положительных результатах PH изолят считают полностью идентифицированным (37).

РТГА. Ставят её микрометодом при 4°С с 0,5-1%-ной взвесью эритроцитов белых мышей, разбавитель - трис-буферный р-р с 0,2% БСА. В качестве АГ используют культуральную жидкость, которую концентрируют ПЭГ-6000 или ультрацентрифугированием (7).

ELISA. Иммунопероксидазный метод можно использовать для исследования прижизненно взятых нозофарингиальных мазков-отпечатков в клетках, полученных из носовых смывов. Кроме того, для лабораторной идентификации вируса ИРТ рекомендован непрямой антикомплементарный иммунопероксидазный метод НАИП (7). При световой микроскопии он обеспечивает четкое выявление вирусного АГ в цитоплазме инфицированных клеток в виде окрашенных в коричневый цвет образований, которые видны при увеличении в 140 раз. Специфичность показателей, полученных этим методом, подтверждается постановкой специальных иммунологических контролей. При постановке перекрестной иммуноперокси- дазной реакции с гетерологичными АГ эта реакция имеет выраженный видоспецифический характер: АГ реагирует только с гомологичной сывороткой. Эндогенная пероксидаза в культуре клеток ПЭК и LF не выявляется.

Таким образом, НАИП является перспективным при диагностике острых респираторных вирусных инфекций КРС (7, 8). При использовании его для индикации вируса ИРТ в культуре клеток ПЭК АГ выявляется через 18-22 ч после заражения. Три прямых серологических метода быстрого обнаружения вирусных АГ (ИФ, ИФА и ELISA) одинаково применимы для обнаружения вируса во время лихорадки, но не на поздних стадиях болезни.

Идентификация с помощью монАТ антител. Иммунопероксидазный метод с использованием монАТ является более чувствительным и специфичным по сравнению с обычными методами выделения вируса. Помимо того, данный метод имеет преимущество в быстроте получения результатов (32). Быстрое подтверждение вируса ИРТ (инфекции) возможно методом культивирования его с последующим ИФА зараженной культуры с использованием монАТ (51). Проведена молекулярная характеристика южноамериканских изолятов герпес- вируса-1 (ИРТ) КРС с помощью монАТ и электрофореза в полиакриламидном геле с доде- цилсульфатом натрия (52).

Идентификация посредством рестрикционного анализа ДНК. Описаны методы клонирования фрагментов генома вируса ИРТ, выделение и характеристика рекомбинантного ДНК-зонда, которые позволяют определять вирус в клинических пробах. Усовершенствована гибридизационная тест-система, основным компонентом которой является биотинили- рованный 1-нитевый ДНК-зонд (1). С помощью метода дот-блот-гибридизации выявлена ДНК вируса ИРТ в пробах спермы, полученной от серопозитивных животных, когда выделение вируса в культуре клеток давало отрицательный результат. Хороший результат также получен при использовании инфицированных культур клеток.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. АТ к вирусу ИРТ можно обнаружить в сыворотках крови больных и переболевших животных в PH, РНГА и др. Для постановки ретроспективного диагноза используют парные пробы сывороток, взятые с интервалом в 3 нед. Результат серодиагностики учитывают по возрастанию титра АТ в парных пробах сыворотки, а также числа серопозитивных животных через указанный интервал (62).

PH. Ставят методом разведения испытуемых сывороток с постоянной дозой вируса в культуре клеток ПЭК или ТБ. Вирус предварительно титруют в культуре клеток. Зараженные и контрольные культуры инкубируют при 37°С, ежедневно учитывая ЦПД вируса, окончательный учет проводят на 5-7-е сут. Наибольшей чувствительностью обладает PH, основанная на 24-ч инкубации смеси вирус-сыворотка (7, 36). Титром вируса считают обратную величину его наибольшего разведения, вызывающего ЦПД в 50% культур, который высчитывают по методу Рида и Менча, или Кербера и выражают в ТЦДз0/мл. Титры 1:32, 1:64 обнаруживаются редко. В неблагополучных по данной болезни стадах ВНА выявляются у 12% клинически здорового скота. Ретроспективный диагноз на ИРТ ставят при 4- кратном и более приросте АТ в пробах сывороток реконвалесцентов. В настоящее время широко используют микрометод PH (7).

РНГА. Биологическая промышленность нашей страны выпускает эритроцитарный ди- агностикум. РНГА ставят согласно методическим указаниям в микропанелях с U-образными лунками наборов микротитрования Такачи или Титертек по общепринятой методике. Результаты РНГА с используемыми сыворотками оценивают по титрам; положительные -1:16 и выше, сомнительные - 1:8, отрицательные - 1:4, 1:2 и нулевые. Увеличение титров АТ в парных сыворотках в 2-4 раза свидетельствует о наличии инфекции (61). Применяя РНГА, можно обнаружить АТ в более ранний период инфекции, чем с помощью PH. Установлено соответствие результатов РНГА и PH в 95% случаев. Высокие титры чаще выявляли в РНГ А. С помощью данной реакции легче и быстрее, чем PH проводить типирование АТ к вирусу ИРТ. Титры АТ были в 7-10 раз выше выявляемых в PH (7).

РДП. Не нашла широкого применения в диагностической практике, хотя многие исследователи рекомендуют её использовать для серодиагностики ИРТ. Marchang (1982) считает, что диагностика по наличию ПА имеет ряд преимуществ по сравнению с PH: она проще и быстрее в постановке, чем PH. ПА обнаруживают вскоре после введения вируса в организм, но они быстро исчезают. По наличию ПА можно уловить недавно прошедшую инфекцию, в то время как ВНА длительно циркулируют в организме, и заболевание можно уловить толь ко по парным сывороткам (7). При выявлении ПА лучше всего брать пробы крови на 8-й и последующие дн болезни.

РТГА. Может использоваться для выявления и количественной оценки АТ к вирусу ИРТ. Титр анти-Г А коррелирует с титром ВНА (7). Положительный результат РТГ А уже в 1-ом разведении сыворотки (1:4) указывает на наличие АТ к вирусу ИРТ в данной пробе сыворотки. 4-кратный и более прирост титров анти-Г А в парных пробах сыворотки является показателем активной инфекции.

ELISA. Широко применяют в Нидерландах, США, Великобритании, Швеции, странах бывшего СССР. Он оказался пригодным для обнаружения АТ к вирусу ИРТ в молоке. Для этого достаточно получения проб смешанного молока от 5-10 коров. АТ определяют после предварительного концентрирования в них lg. Совпадаемость данных серологических реакций в пробах сыворотки крови и молока составляла 92,8%. С помощью данного метода можно оперативно определять иммунологический статус поголовья лактирующих коров целого региона, а также проводить обследование экспортируемых и импортируемых животных (24). В ФРГ разработан и применяется метод ТРАХИТЕСТ для ИФА проб сборного молока коров с целью диагностики скрытого вирусоносительства (7).

Предложен непрямой метод IgM-ELISA для определения недавней инфекции ИРТ. Ранние AT IgM выделены на 6-й дн после заражения, к 9-му дн происходил рост титра AT lg, а к 13-му дн - ВНА. У телят, привитых инактивированной вакциной, раннего иммунного ответа не происходило - AT IgM не выявлялись, a IgM и ВНА появлялись позже, чем после заражения. Однако при этом следует иметь в виду, что наличие в сыворотке КРС ревматоидного фактора может привести к ложноположительным результатам диагностики в IgM- ELISA. В этом случае предварительная обработка проб сыворотки антибычьими IgM позволяет избежать ложноположительных результатов. Тест IgM-ELISA имеет большую ценность в диагностике ИРТ, особенно у молодых животных. В группе позитивных сывороточных проб корреляция между ELISA и РНГА составляла 98,3%, a ELISA с ИФ - 95,7% (17).

ELISA с использованием монАТ. Основан на конкуренции между АТ сыворотки крови КРС и нейтрализующими мышиными монАТ. Для его проведения лунки микротитраци- онных панелей обрабатывают очищенным вирусом ИРТ, и после высушивания их можно использовать немедленно или хранить при - 20° С. В обработанные вирусом лунки панелей последовательно вносят неразведенную испытуемую сыворотку, специфические к вирусу ИРТ монАТ, конъюгированные пероксидазой, субстрат пероксидазы. Результаты реакции учитывают в спектрофотометре при А405. В случае положительной реакции связывание монАТ ингибируется АТ сыворотки крови. Метод оказался намного чувствительнее и специфичнее PH.

Аллергическая проба. Установлено, что при экспериментальном заражении наступает аллергизация организма, проявляющаяся положительной кожной аллергической реакцией уже на 7-й день после заражения, а при вакцинации живой вакциной это происходит через 2 нед после вакцинации, при естественном заражении (спонтанные аборты) аллергизация также наступает быстрее. В Болгарии и ФРГ применяют кожно-аллергическую реакцию для выявления переболевших и вакцинированных животных (8).

С целью унификации методов дифференциальной диагностики болезней, проявляющихся с везикулярным синдромом, получены высокоактивные препараты для идентификации возбудителей ИРТ и ВД КРС. Использование этих праймеров при вирусологической экспертизе патологических материалов оказалось особенно полезным при смешанном течении ящура и указанных болезней. Применение ранее разработанных для диагностики ящура методов изготовления специфических АГ и антительных препаратов дает возможность изготовления аналогичных по качеству диагностикумов при идентификации вирусов ИРТ и В Д и унификации для схемы дифференциальной диагностики основных болезней, протекающих с везикулярным синдромом и наиболее часто осложняющих диагностику ящура (41).

<< | >>
Источник: Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьёв Б.В., Фомина Н.В.. Вирусные болезни животных. - Москва, ВНИТИБП, 928 с, ил.. 2001

Еще по теме ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ:

  1. ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
  2. ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
  3. ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
  4. ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
  5. ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
  6. ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
  7. ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
  8. ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
  9. ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
  10. ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
  11. ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ I
  12. ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
  13. ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
  14. ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ