<<
>>

ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОЧВЕННОЙ БИОТЫ


Метод стекол обрастания. «Микробный пейзаж» может быть получен методом стекол обрастания Росси — Холодного,, который заключается в следующем. В небольшом почвенном разрезе одну из стенок зачищают и, делая ножом вертикальную щель, закладывают в нее стерильные предметные стекла, плотно прижимая их к почве.
Закапывают разрез, отмечая колышком местонахождение препаратов. Если почва содержит достаточно влаги, то закопанное стекло вскоре покрывается почвенным раствором, к его поверхности прилипают коллоидные частички органического и минерального происхождения. В этой среде поселяются и активно развиваются различные микроорганизмы, образующие на стеклах характерные для данной почвы микропейзажи. По истечении срока экспозиции (не менее одного месяца) стекло осторожно отделяют от почвы (не скользящим движением), подсушивают на воздухе, фиксируют в пламени горелки, отмывают осторожно препарат водой от крупных частиц почвы (для этого можно оставить стекло в стакане с водой в наклонном положении на несколько часов), окрашивают 1%-ным карболовым эритрозином в течение 1 ч во влажной камере, промывают дистиллированной водой, высушивают и микроскопируют. Метод широко применяется в микробиологической практике. С помощью этого метода впервые оказалось возможным наблюдение за распределением различных микроорганизмов в их природной среде обитания, наблюдение за формой и размерами группировок микроорганизмов, их взаимоотношениями.
Модификация метода заключается в том, что стекла перед помещением в почву покрывают какой-нибудь питательной средой (крахмало-аммиачным агаром, например, согласно модификации А. В. Ры- балкиной и Е. В. Кононенко) или специфическим субстратом (например, фильтровальной бумагой, льняной тканью и т. д.).
Метод капиллярных педоскопов. В естественных условиях развитие микроорганизмов происходит в основном в почвенных капиллярах, к стенкам которых прикрепляются. почвенные микроорганизмы. Исходя из этого положения, Б. В. Перфильев и Д. Р. Габе (1961) [2] предложили использовать для наблюдения за живой почвенной микрофлорой капилляры с плоокопараллельными стенками. Был сконструирован специальный прибор — педоскэп, состоящий из набора таких капилляров.
Стерильные педоскопы вставляют в почву с помощью специального пробойника так, чтобы каналы капиллярных ячеек приняли вертикальное положение, т. е. соответствовали преобладающему направлению тока почвенного раствора. Экспозиция педоскопов в почве длится обычно в течение месяца, после чего педоскопы вынимают из почвы, очищают снаружи от почвенных частичек и рассматривают под микроскопом с иммерсионной системой объектива. Микробы в иедоскопах могут быть зафиксированы и окрашены. Фиксируют их в парах осмиевой кислоты или в парах 40%-ного раствора формалина. Окрашивают 1%-ным раствором карболового эритрозина, промывают водой.
Модификация метода, предложенная Т. В. Аристовской, состоит в том, что внутренние стенки капилляров покрывают средой, содержащей ту или иную фракцию гуминовых кислот. 50 г почвы заливают 1 л 0,1 н. раствора NaOH и через 18—20 ч отфильтровывают. Реакция среды должна быть слабокислой, pH фильтрата осторожно доводят 0,2 н. НС1 до 5. Затем в фильтрат по капле прибавляют 20%-ный раствор FeCU до полного выпадения гумусовых веществ в форме геля, который отфильтровывают и отмывают от следов хлора (проба с 1%-ным раствором AgN03).
Около 5 мл геля растирают в ступке, взбалтывают в 1 л воды, вносят в 0,1%-ный раствор агара и стерилизуют. Педоскоп
боковой стороной помещают в расплавленную среду, тщательно протирают снаружи стерильной ватой, подсушивают.
Метод люминесцентно-микроскопического наблюдения микроорганизмов в почвенных монолитах по Звягинцеву. Приготовляют цилиндрическую формочку размером 1x1 см из нержавеющей стали, пластмассы или стекла, имеющую острые края. Вдавливают формочку в почву исследуемого горизонта и осторожно вынимаюд ее так, чтобы над краями формочки возвышался слой'почвы. Острой бритвой срезают почву, чтобы верхняя грань монолита была на уровне краев формочки. На поверхность почвы капают раствор акридина оранжевого и накрывают ее очень тонким покровным стеклом (0,10—0,12 мм). Через 10—20 мин исследуют в люминесцентном микроскопе с иммерсионным объективом (90Х) в отраженном свете. Основные трудности метода заключаются в подборе подходящей концентрации красителя; для каждой почвы она подбирается опытным путем.
Электронно-микроскопические исследования почвенных микроорганизмов. Разрешающая способность электронных микроскопов достига- •ei 2 А. Современные электронные микроскопы позволяют увидеть даже атомы тяжелых металлов. В настоящее время получили распространение два типа электронных микроскопов: просвечивающие или трансмиссионные ‘(ТЭМ), в которых исследуемый объект просвечивается пучком электронов, создающим затем на экране или фотопластинке соответствующее изображение, и растровые, или сканирующие (СЭМ), в которых изображение создается вторичными электронами, испускаемыми исследуемой поверхностью при облучении ее пучком первичных электронов. Электронные микроскопы просвечивающего типа отличаются более высокой разрешающей способностью, однако они пригодны только для изучения очень тонких образцов (с толщиной, не превышающей 500 А). Поэтому в микробиологии и почвоведении более широкое применение находит растровая электронная микроскопия, позволяющая исследовать непрозрачные объекты. В растровом электронном микроскопе высокая разрешающая способность сочетается с большой глубиной резкости, широким полем зрения и большим диапазоном увеличений.
Подготовка препаратов для электронной микроскопии — сложный и трудоемкий процесс. Подложка препаратов для микроскопов просвечивающего типа должна быть очень тонкой (10—15 мкм) и проницаемой для электронов. Такие пленки изготовляют из коллодия, формвара, угля и кварца и помещают на металлические сетки. Диаметр предметных сеток равен 2—3 мм. На пленки наносят суспензию микроорганизмов и после испарения воды препарат просматривают. Часто препарат подвергают дополнительной обработке — оттенению металлом (золотом, платиной, палладием, хромом или ураном). Напыление металлом производят под вакуумом. Такая дополнительная обработка повышает контрастность изображения. При микроскопировании почвенной суспензии ее очищают от растворимых веществ путем диализа.
Основное требование, предъявляемое к образцам для растровой электронной микроскопии, — максимальное сохранение их первона-
чальной структуры. Это требование осложняется тем, что наблюдение на" растровом электронном микроскопе ведется в условиях вакуума и образец находится под действием электронного пучка. Кроме того, препараты для растрового электронного микроскопа должны быть электропроводными, поэтому исследуемые диэлектрические препараты необходимо напылить металлами, препятствующими зарядке поверхности или обеспечивающими стекание зарядов с поверхности образца. Препарирование образцов для растрового электронного микроскопа включает ряд операций, в том числе дегидратацию и высушивание образцов без нарушения их морфологической структуры и напыление поверхности тяжелыми металлами. Исследуют образцы, не превышающие 10 мм в диаметре, поверхность образца не должна иметь больших неровностей, так как наличие неровностей сказывается на фокусе изображения и препятствует равномерному напылению образца металлом. Высушенные образцы наклеиваются на металлические столбики и после напыления металлом просматриваются под микроскопом.
Методы исследования адсорбции почвенных микроорганизмов. Для изучения адсорбции микроорганизмов почвенными частичками пользуются косвенными и прямыми методами. Метод Диановой и Ворошиловой заключается в следующем. В большую пробирку вносят 5 г почвы и 1 мл бульонной культуры исследуемого микроорганизма. Такое же количество клеток вносят в другую пробирку, не содержащую почвы. Затем в обе пробирки вносят по 9 мл стерильной водопроводной воды. После минутного встряхивания и 10-минутного отстаивания из верхнего слоя жидкости обеих пробирок производят посев на питательную среду для учета количества микроорганизмов. По разности определяют количество адсорбированных клеток и вычисляют процент адсорбции. Метод достаточно прост и нашел широкое применение при изучении адсорбции искусственно внесенных в почву клеток микроорганизмов.
Применение метода люминесцентной микроскопии дает возможность видеть адсорбированные клетки непосредственно на почвенных частицах (Звягинцев, 1973). Поскольку большинство микробиологических объектов не обладает собственной люминесценцией или обладает ею в слабой степени, микроорганизмы окрашивают обычно специальными красителями-флуорохромами (например, акридином оранжевым), которые обусловливают свечение клеток. При проведении работы важно точно подобрать оптимальную концентрацию красителя. Только в этом случае клетки будут достаточно хорошо видны. Например, можно подобрать такую концентрацию, когда почвенные частицы светятся красным, а адсорбированные на них клетки — зеленым. Опыты проводят с применением отраженного света. Иногда свечение почвенных частиц затрудняет рассмотрение прикрепленных к ним клеток микроорганизмов, особенно при рассмотрении почвенных монолитов, где почвенные частицы составляют сплошной светящийся фон. Ослабление свечения фона достигается применением тушителей (например, пирофосфата натрия 0,5—1%).

Большие возможности для изучения адсорбции микроорганизмов б почве дает сканирующая электронная микроскопия. При использовании сканирующего электронного микроскопа удается видеть отдельные адсорбированные клетки микроорганизмов и их микроколонии. 
<< | >>
Источник: И. П. БАБЬЕВА, Г. М. ЗЕНОВА. Биология почв. 1983

Еще по теме ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОЧВЕННОЙ БИОТЫ:

  1. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОЧВЕННОЙ БИОТЫ
  2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ФУНКЦИЙИ ИНДИКАТОРНЫХ СВОЙСТВ ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
  3. Экологические особенности почвенных водорослей
  4. 2.2.3. 2. Экологические группы почвенных организмов
  5. alt="" />Неблагоприятные экологические процессы и их влияние на почвенный покров городов
  6. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЧВЕННЫХ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ
  7. Занятия по исследованию почвенных животных,рекомендуемые во время летней практики студентов
  8. методика экспериментальных исследований АГРЕГАЦИИ ПОЧВЕННЫХ ЧАСТИЦ
  9. ИССЛЕДОВАНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ ГРУПП ПОЧВЕННЫХ ОРГАНИЗМОВ
  10. Методы изучения шмелей на фуражировочном участке: полевые методы исследования экологии и этологии шмелей
  11. Методы исследования
  12. Экологическая пластичность и методы ее анализа