<<
>>

Нитрогеназная активность штаммов псевдомонади азотобактера

Изучение особенностей биологической азотфиксации имеет большое значение для функционирования наземных экосистем. Растения потребляют, в основном, почвенный азот, причем даже в том случае, когда в почву вносятся высокие дозы минерального азота. Основная масса азота содержится в органическом веществе почвы, которое состоит из гумусовых и негумифицирован- ных веществ растительного и животного происхождения. Лишь незначительная часть азота входит в состав неорганических соединений в нитратной и аммонийной формах, способной усваиваться растениями.

За счет ассоциативной азотфиксации в фитоплану луговых и зерновых злаков в зоне умеренного климата поступает 30-40 кг азота/га за вегетационный период, тогда как в почве без растений только 10-13 кг азота/га/год. Растения стимулируют деятельность диазотрофных бактерий и определяют суточную и сезонную динамику ассоциативной азотфиксации. Наиболее важную роль в стимуляции играют продукты экзоосмоса и корневой опад, являющиеся энергетическим субстратом для диа- зотрофов. Высокая поглотительная деятельность корней способствует быстрому оттоку азотсодержащих продуктов метаболизма бактерий и поддерживает высокую активность нитрогеназы. Метаболитами азотфиксирующих бактерий являются аминокислоты, аминосахара и продукты их частичной амонификации, которые потребляются растениями. Оптимальный уровень параметров среды для роста растения соответствует и ее оптимуму для ассоциативной азотфиксации [Умаров, 1986].

Целью наших исследований было изучение нитрогеназной активности выделенных штаммов псевдомонад и азотобактера.

Определение нитрогеназной активности штаммов проводили методом, основанным на восстановлении ацетилена [Методы..., 1984, Умаров, 1986].

Исследуемые микроорганизмы родов Pseudomonas и Azotobacter культивировали на среде Эшби с добавлением следов Na2Mo04 • 2Н20 в условиях аэрации. Ацетилен вводили в сосуды с культурами до концентрации 10% (по объему). После инкубации культур в атмосфере ацетилена в течение 1,5 ч отбирали шприцем пробы газа по 1 мл из сосуда и определяли наличие этилена методом газовой хроматографии на газовом хроматографе “Кристалл Люкс 4000” с пламенно-ионизационным детектором.

Нитрогеназную активность бактерий р. Pseudomonas определяли через 72 ч культивирования. Активность фермента нитрогеназы бактерий р. Azotobacter определяли на 48-м и 72-м часах роста культур. Также для азотобактера нитрогеназная активность была определена на среде Берка [Рубенчик, 1960], на среде 40 с использованием в качестве источников углеродного питания глюкозы, сахарозы, калия виннокислого, натрия уксуснокислого.

По результатам проведенных экспериментов установлено, что на агаризованной среде Эшби хорошо растут штаммы Р. aureofaciens ИБ 51 и Р. aureofaciens ИБ 6. Следует отметить, что при росте на безазотистой среде данные микроорганизмы не образуют характерного ярко-оранжевого пигмента. В то же время было показано, что наибольшей ацетиленредуктазной способностью в жидкой культуре обладает штамм Pseudomonas sp. ИБ 182, который характеризовался слабым ростом при выращивании на плотной среде Эшби (табл. 12).

Таким образом, для штамма Pseudomonas sp. ИБ 182 выявлено наличие азотфиксирующей активности. Причем нитрогеназная активность штамма (0,43 мкг Г^мл/ч) сопоставима с аналогичной характеристикой для бактерий р. Azotobacter - типичных представителей азотфиксирующих микроорганизмов [Пат.

РФ 2074159]. Штамм Pseudomonas species ИБ 182 запатентован в качестве продуцента хитинолитических ферментов [Пат. РФ 2187553].

Штамм

Рост на агаризован- ной среде Эшби

Нитрогеназная

активность,

мкгЫ2/мл/ч

Р. aureofaciens ИБ 51

++

0,0801±0,012

Р. aureofaciens ИБ 6

++

-

Р. putida ИБ 56

+

-

P.putida ИБ 17

+

-

Pseudomonas sp. ИБ 182

+

0,4312±0,023

Примечание. (++) - хороший рост; (+) - слабый рост.

Для изучения азотфиксирующей способности выделенных нами штаммов бактерий р. Azotobacter были поставлены эксперименты по определению нитрогеназной активности в условиях in vitro в жидкой культуре [Пугачева и др., 2004]. В эксперименте использовали также два штамма, полученные из ВКМ (Az. vinelandii В-1617, Az. chroococcum В-1616).

При определении нитрогеназной активности в жидкой культуре было установлено, что ее величина не зависела от температуры культивирования штаммов азотобактера и была одинаковой при 25° и 35° (табл. 13). При культивировании смешанной культуры нитрогеназная активность была значительно выше, чем у отдельных штаммов в аналогичных условиях, что согласуется с данными некоторых авторов [Умаров, 1986; Белимов, Кожемяков, 1992]. Кроме того, эта зависимость прослеживалась при росте на всех испытуемых источниках углерода.

Мы выявили лишь незначительную разницу в величине нитрогеназной активности при выращивании культур на таких источниках углеродного питания, как маннит, сахароза и глюкоза (табл. 14). Величина фиксации азота при росте на глюкозе была несколько ниже, чем при росте на сахарозе и манните. Поэтому при дальнейшем культивировании штаммов азотобактера, прежде всего, необходимо ориентироваться на источник углерода, на котором достигается высокий выход биомассы и который не относится к дорогим субстратам. Мы выбрали в качестве такого источника сахарозу, поскольку при выращивании на среде с использованием 10 г/л сахарозы в качестве источника углеродного питания большинство штаммов при температуре 23° достигали за 48 ч культивирования численности 108 КОЕ/мл КЖ, причем нитрогеназная активность в данном случае была высокой для всех штаммов.

Таблица 13. Значение нитрогеназной активности штаммов р. Azotobacter при выращивании на среде Эшби с маннитом при различных температурах

Культура бактерий

Нитрогеназная активность на 48-м часу культивирования. мкгЫ2/мл/ч

25°

35°

Az. vinelandii ИБ 1

0,650010,021

0,6497Ю,018

Az. vinelandii ИБ 3

0,6133±0,018

0,6369Ю,015

Az. vinelandii ИБ 4

0,6423±0,019

0,6435Ю,032

Az. vinelandii В-1617

0,6475Ю,101

0,647010,023

Az. chroococcum B-1616 Смешанная культура:

0,6555Ю,031

0,653810,012

Az.

vinelandii ИБ \,Az. vinelandii ИБ 3, Az. vinelandii ИБ 4

0,7407Ю,023

/>нд

Культура бактерий

Нитрогеназная активность на 72-м часу культивирования мкгЫ2/мл/ч

25°

25°

Az. vinelandii ИБ 1

0,647410,210

0,650810,025

Az. vinelandii ИБ 3

0,641610,012

0,642110,147

Az. vinelandii ИБ 4

0,647510,130

0,648010,123

Az. vinelandii В-1617

0,642610,112

0,646710,014

Az. chroococcum B-1616

0,656010,270

0,654110,023

Смешанная культура:

Az. vinelandii ИБ \yAz. vinelandii

0,741110,089

нд

ИБ 3, Az. vinelandii ИБ 4

Примечание, нд - нет данных.

Таблица 14. Величина нитрогеназной активности штаммов р. Azotobacter при выращивании на среде 40 с сахарами

Культура бактерий

Нитрогеназная активность, мкгЫ2/мл/ч

Сахароза

Глюкоза

Az.vinelandii ИБ 1

0,655310,012

0,468310,024

Az.vinelandii ИБ 3

0,634410,021

0,423010,007

Az.vinelandii ИБ 4

0,647610,003

0,432710,014

Az.vinelandii В-1617

0,655310,022

0,412310,031

Az.chroococcum B-1616 Смешанная культура:

0,642310,014

0,398910,017

Az. vinelandii ИБ 1, Az. vinelandii ИБ 3, Az. vinelandii ИБ 4

0,712310,016

0,515610,023

Таблица 15. Нитрогеназная активность штаммов р. Azotobacter при выращивании на среде 40 с солями органических кислот в качестве источника углерода

Нитрогеназная активность, мкгЫ2/мл/ч

Культура бактерий

Калий виннокислый

Натрий уксуснокислый

Az. vinelandii ИБ 1

0,0714±0,002

0,0627±0,003

Az. vinelandii ИБ 3

0,0722±0,001

0,0649±0,001

Az. vinelandii ИБ 4 Смешанная культура:

0,0679±0,004

0,0615±0,007

Az. vinelandii ИБ 1, Az. vinelandii ИБ 3, Az. vinelandii ИБ 4

0,0835±0,002

0,0692±0,002

Крайне незначительное повышение нитрогеназной активности (или ее отсутствие) при увеличении титра объясняется природой процесса азотфиксации. Микроорганизмы р. Azotobacter, фиксируя молекулярный азот, выделяют в среду азотсодержащие соединения (аминокислоты, аминосахара, аммонийный азот), а, как известно, наличие в среде любых форм азота ингибирующе действует на процесс азотфиксации [Умаров, 1986]. Поэтому в дальнейшем в качестве азотного питания клетки потребляют накопленный в среде азот, не затрачивая энергию на фиксацию азота. Интересные результаты получены при культивировании микроорганизмов на солях органических кислот. При относительно высоком титре клеток 105-106 КОЕ/мл величина нитрогеназной активности оказалась на порядок ниже, чем при выращивании на сахарах (табл. 15).

Таким образом, для всех трех выделенных штаммов Az. vinelandii была изучена интенсивность азотфиксации в зависимости от источника углеродного питания, времени и температуры культивирования. Было отмечено, что максимальная величина нитрогеназной активности приходится на период экспоненциальной фазы развития культур и не зависит от количества жизнеспособных клеток в среде. Величина нитрогеназной активности при росте на сахарозе и манните была в 1,3 раза выше, чем при культивировании на глюкозе и в 8,8 раз выше при росте на солях органических кислот.

Определение величины усваиваемого азота в смешанной культуре, состоящей из трех штаммов азотобактера, показало, что при росте на всех используемых источниках углерода азот- фиксация смешанной культурой в 1,2 раза превышает способность к фиксации азота у чистых культур. 

<< | >>
Источник: о.н. логинов. БАКТЕРИИ Pseudomonasи Azotobacter как объектысельскохозяйственнойбиотехнологии. 2005

Еще по теме Нитрогеназная активность штаммов псевдомонади азотобактера:

  1. Исследование способности к разложению фосфатову штаммов псевдомонад и азотобактера
  2. Изучение ростстимулирукнцей активностиштаммов псевдомонад и азотобактера
  3. Особенности антагонистического действия  штаммов псевдомонад и азотобактерана фитопатогенные грибы
  4. Использование штаммов псевдомонад и азотобактерав качестве агентов биологического контролязаболеваний овощных культур
  5. Изучение эффективности применения штаммов псевдомонад и азотобактерадля защиты пшеницы от корневых гнилей и альтернариозав условиях вегетационных,полевых и производственных испытаний
  6. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИПРИМЕНЕНИЯ НОВЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙРОДОВ PSEUDOMONAS И AZOTOBACTERДЛЯ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ БОЛЕЗНЕЙИ ПОВЫШЕНИЯ УРОЖАЙНОСТИСЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР
  7. Применение биопрепаратовна основе псевдомонад и азотобактерадля защиты растений от болезней
  8. ВЫДЕЛЕНИЕ И ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКАНОВЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙРОДОВ PSEUDOMONAS И AZOTOBACTER -АНТАГОНИСТОВ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ
  9. Оценка эффективности применения штаммов бактерий р. Pseudomonasпротив твердой головни в условиях защищенногои открытого грунтов
  10. ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКАИ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТАБОЛИТОВ,ОБЛАДАЮЩИХ ФУНГИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ,ПРОДУЦИРУЕМЫХ БАКТЕРИЯМИ РОДОВ PSEUDOMONASИ AZOTOBACTER
  11. Летная активность.
  12. Биологическая активность почв
  13. 2. Принцип активности
  14. Угнетение каталитической активности. 
  15. 2* Идея активности в эволюционных учениях
  16. 2** Изменения активности. Давление нормы
  17. Активность и поведение