<<
>>

Разработка твердыхпрепаративных форм биопрепаратов


Жизнеспособность клеток микроорганизмов и стабильность их свойств при хранении в жидкой культуре (как один из возможных вариантов препаративной формы биопрепаратов) определяются не только условиями хранения, но и особенностями микроорганизма, составляющего основу того или иного препарата.
Известно, что в некоторых случаях чистые культуры микроорганизмов, в частности бактерий-антагонистов, при пересевах на искусственные питательные среды способны диссоциировать на формы разной активности [Никонорова, 1996]. Это приводит к постепенному снижению или даже к полной утрате некоторых свойств антагониста.
Необходимость проведения исследований для выяснения однородности и стабильности свойств выделенных штаммов микроорганизмов (антагонистических для препаратов сельскохозяйственного назначения) вызвана чувствительностью бактерий к различным способам хранения и поддержания их при лабораторном и промышленном культивировании.
Изучение выживаемости штаммов р. Pseudomonas в условиях жидкой культуры проводили на среде Кинг ВТ. В каждом из вариантов опыта использовали двухсуточную КЖ в объеме 100 мл. Конические стеклянные колбы объемом 250 мл с КЖ штаммов хранили при разных температурных режимах: в холодильнике (6°), термостате (26°), а также при комнатной температуре (20°). Численность жизнеспособных клеток определяли путем высева тщательно перемешанного содержимого колб на среду МПА из серийных разведений и подсчета выросших колоний.
Для исследования влияния адсорбирующих материалов на жизнеспособность и антифунгальную активность штаммов псевдомонад в качестве носителей использовали оксид алюминия (глинозем) А1203, оксид магния (жженая магнезия) MgO, а также каолин-глину белого цвета, состоящую из природного глинистого минерала каолинита. Материалы-носители стерилизовали сухим жаром при 180° в течение 3 ч. В качестве объекта исследования был выбран штамм Р. aureofaciens ИБ 51, который выращивали в жидкой культуре в течение 2 сут. Титр бактериальной

суспензии - 1,2 • 1010 КОЕ/мл. В стерильные материалы вносили КЖ штамма из расчета 30 и 50% по массе и тщательно перемешивали до получения однородной массы стерильным шпателем. Полученные препараты хранили в холодильнике при 6°. Для контроля стерильности носителей перед началом эксперимента, а также для учета численности жизнеспособных клеток на адсорбентах в течение опыта вносили по 1 г навески препарата в колбы со 100 мл стерильной воды, затем содержимое колб перемешивали в течение 40 мин на качалке (п = 100 об/мин) и проводили высев из серийных разведений на МПА.
Для изучения возможности хранения культур на силикагеле за основу был взят метод Д. Перкинса [Методы..., 1982]. Объектом исследования послужил штамм Р. putida ИБ 17. Для приготовления бактериальной суспензии культуру выращивали на косяке МПА в течение 5 дней. Флакон (10 мл), наполовину заполненный силикагелем КСМГ (ГОСТ 3956-76), стерилизовали сухим жаром при 180° в течение 1,5 ч и затем вносили 0,5 мл бактериальной суспензии, полученной смывом стерильным обезжиренным молоком с косяка (титр 1,9 • 109 КОЕ/мл). Содержимое флакона тщательно перемешивали и хранили его в закрытом состоянии в холодильнике при 5°. Проверку жизнеспособности клеток штамма на силикагеле осуществляли путем высева нескольких бусин на свежий косяк МПА.
Косяк помещали в термостат при 28° на неделю. О жизнеспособности культуры судили по колониям бактерий, образующимся на МПА вокруг бусин силикагеля.
Метод хранения микроорганизмов в лиофильно-высушенном состоянии - один из наиболее оптимальных способов длительной консервации культур в лабораторных условиях. Целью наших исследований было выяснение вопроса о влиянии лиофилиза- ции на антагонистические свойства культур псевдомонад и азотобактера.
Для подготовки культур к лиофилизации их выращивали на агаризованных средах Кинг В (для штаммов псевдомонад), Федорова (для штаммов азотобактера) сплошным газоном в течение 2 сут. Среда Федорова была выбрана в связи с тем, что на ней (источник углерода - меласса) штаммы выделяют экзополисахарид, который выполняет защитную функцию при высушивании клеток микроорганизмов.
Далее клетки суспендировали в среде, содержащей 24%-ный раствор сахарозы, разведенный равным объемом соответствующей стерильной питательной среды. В каждую ампулу наливали по 400 мкл суспензии бактерий. Лиофилизацию проводили в течение 20 ч на лиофильной сушилке “Иней 3-2”. Восстановление культур из лиофилизированного состояния и проверку жизнеспо-

Время хранения, мес

Жизнеспособность
клеток

Диаметр зоны подавления роста Bipolaris sorokiniana, мм

0

+

31,5±0,5

0,5

+

27,0±3,0

1,5

+

31,0±1,0

2,5

+

31,5±0,5

4,5

+

32,5±0,5

12

+

32,5±0,5

собности бактерий проводили в соответствии с рекомендациями, описанными в “Методах общей бактериологии” [1984).
Установлено, что штаммы микроорганизмов Р. aureofaciens ИБ 51, Р. aureofaciens ИБ 6, Р. putida ИБ 17, Р. putida ИБ 56, Pseudomonas sp. ИБ 182; Az. vinelandii ИБ 1, Az. vinelandii ИБ 3, Az. vinelandii ИБ 4 в лиофильно-высушенном состоянии сохраняют длительное время (до полутора лет) свои свойства без потери активности.
Перкинс [Методы..., 1982] ранее сообщал о том, что предложенный им метод хранения на силикагеле пригоден для штаммов, образующих конидии. Проведенные нами исследования показали, что подобный метод консервации культур микроорганизмов может быть использован также и для неспорообразующих видов бактерий. В табл. 48 представлены данные, подтверждающие возможность длительного хранения штамма Р. putida ИБ 17 на силикагеле при пониженной температуре. Следует отметить, что подобный способ консервации культуры позволил не только сохранить жизнеспособность клеток штамма, но и в течение 12 мес поддерживать на исходном уровне его антагонистическую активность в отношении фитопатогенных грибов.
Разработана твердая препаративная форма биопрепарата азолен. Экспериментально установлено, что биомасса микроорганизмов Az. vinelandii ИБ 4, адсорбированная на твердом носителе (каолин) при массовом соотношении носителя и культуральной жидкости, составляющем 1 : 0,1-0,03, и подвергнутая вакуумной сушке (остаточное содержание воды - 1-10 мас.%), способна сохранять в течение 4 мес высокий титр микроорганизмов на уровне 1 • 1010 КОЕ/г. При этом антагонистическая активность микроорганизмов по отношению к грибным фитопатогенам остается стабильной величиной.

Время
хранения, мес

Количество клеток. КОЕ/мл

20°

26°


0

(1,1 ±0,0) • 10ю

(1,1±0,4) • Ю10

(1,0±0,1) - 10ю

0,5

(6,3±1,0) • ю9

(5,9±3,8) • 109

(1,3±0,6)- ю10

1

(3,1 ±0,5) • 10*

(3,6±0,5) • 10*

(6,8±4,4) • 109

1,5

(3,1±0,7) • 10*

(3,5±1,3) • 10*

(8,3±2,1) • 109

2,5

(4,3±0,5) • 10*

(1,8±0,5) • 10*

(2,1±0,5) • 109

4,5

(3,6±0,5) • 10*

(2,9±0,5) • 10*

(2,2±0,5) • 109

12

нд

нд

(1,7±0,6) • 10*
rowspan="2">
Время
хранения, мес

Радиус зоны подавления роста Bipolaris sorokiniana, мм

20°

26°


0

14,0±3,0

12,5±2,5

13,5±1,5

0,5

нд

нд

нд

1

11,5±0,5

11,0±1,0

13,5±1,5

1,5

14,5±2,5

11,0±1,0

13,5±1,5

2,5

10,0±2,0

13,0±2,0

11,5±3,5

4,5

13,5±1,5

15,0±2,0

16,0±2,0

12

нд

нд

13,0±2,0

Примечание, нд- нет данных.



С целью оценки выживаемости псевдомонад в жидкой культуре при различных условиях хранения проведены эксперименты для двух штаммов бактерий-антагонистов р. Pseudomonas: Р. putida ИБ 17 и Р. aureofaciens ИБ 51. У штамма Р. putida ИБ 17 (табл. 49) в условиях хранения при 20 и 26° в течение месяца численность жизнеспособных клеток снизилась на два порядка, далее в течение 4,5 мес титр клеток поддерживался на уровне 1,8-4,3-108 КОЕ/мл. Хранение культуральной жидкости штамма при 6° позволило сохранять численность клеток в пределах 2,1-8,3* 109 КОЕ/мл в течение 4,5 мес. Таким образом, пониженная температура (6°) способствовала выживанию клеток и дала возможность даже по истечении года сохранить титр КЖ на уровне 1,7*108 КОЕ/мл., сохраняя при этом антагонистическую активность штамма Р. putida ИБ 17.
Для представителя другого вида бактерий р. Pseudomonas - Р. aureofaciens ИБ 51 - наблюдался совершенно иной вариант поведения в жидкой культуре (табл. 50). Показано, что уже через 30-45 сут при комнатной температуре, а также при постоянной температуре 26° штамм полностью утрачивает антагонистические

Время
хранения, мес

Количество клеток, КОЕ/мл

20е

26°


0

(1,9±0,2) • Ю10

(2,2±0,6) • Ю10

(8,6±3,2) • 10ю

0,5

(2,5±1,1) - 109

(1,4±0,6) • 10*

(4,2±2,0) • 109

1

(2,8±0,5) • 10*

(1,0±0,1)- 10*

(6,0±2,4) • 10*

1,5

(7,9±0,5) • 107

(9,4±0,5) • 107

(9,1 ±0,5) • 10*

3

(2,3±0,5) • 107

(2,1±0,5) • 10*

(11,6±0,5) * 10*

11

(4,9±0,5) • 107

нд

(1,6±0,7) • 10*

Время
хранения, мес

Радиус зоны подавления роста Вipolaris sorokiniana, мм

20°

26°


0

10,0±2,0

10,0±2,0

10,0±2,0

0,5

11,0±1,0

10,0±2,0

11,0±1,0

1

-

10,0±2,0

12,5±2,5

1,5

-

2,5±0,5

8,0±1,0

3

-

— *

8,0±2,0

11

-

нд

6,0±1,0

Примечание, нд - нет данных; (-)

- активных форм не обнаружено.

свойства. Хранение при 6° позволяет до некоторой степени поддержать антифунгальную активность клеток, но тем не менее за 11 мес ее значение снижается по сравнению с исходным приблизительно в 2 раза. Следует отметить, что, несмотря на подобное непостоянство активности данного штамма в жидкой культуре, титр жизнеспособных клеток поддерживался на достаточно высоком уровне (1,9 -8,6 • 1010 КОЕ/мл - исходный титр, через 11 мес хранения 4,9 • 107 КОЕ/мл - при комнатной температуре и • 108 КОЕ/мл - в холодильнике).
Следующий этап работы - изучение различных вариантов хранения штаммов псевдомонад на твердых дисперсных материалах. В качестве адсорбентов использовали оксид алюминия, оксид магния, а также каолин в количестве 50 и 70% от общей массы смеси. В качестве объекта исследования был выбран штамм Р. aureofaciens ИБ 51 - основа биопрепарата Елена.
Установлено, что оксид магния не эффективен для хранения исследуемого штамма. Уже через 0,5 мес эксперимента в данной смеси не удалось обнаружить жизнеспособных клеток культуры (табл. 51).
Ряд экспериментов показал, что жизнеспособность культуры обеспечивали каолин и оксид алюминия (глинозем), который

Вариант

Время хранения, мес

Количество клеток, КОЕ/г смеси

Радиус зоны подавления роста Bipolaris sorokiniana,, мм

А12О3-70%

0

(7,3±0.6) • ю9

9,5±2,5

MgO-70 %

0

(2,3±0,6) • 109

9,5±1,5

Каолин-70 %

0

(5,4±0,8) • 109

9,5±2,5

Каолин-50 %

0

(4,2±0,3) • 109

11,0±1,0

А12О3-70%

1

(5,6±0,5) • 10*

5,5±0,5

MgO-70 %

1

*

-

Каолин-70 %

1

(1,4±0,0) • Ю9

9,0±1,0

Каолин-50 %

1

(1,5±0,5) • Ю9

6,0±1,0

А12О3-70%

3

(1,4±04) • 10®

-

Каолин-70 %

3

(3,4±0,5) • 10®

8,0±2,0

Каолин-50 %

3

(5,3±0,5) • 10®

-

А12О3-70%

10

*

-

Каолин-70 %

10

(9,7±0,5) • 106

6,5±0,5

Каолин-50 %

10

(4,2±0,5) • 107

-

* Жизнеспособные клетки не обнаружены; (-) - антагонистическая активность в отношении гриба Bipolaris sorokiniana не обнаружена.

также получают из каолина. При хранении в течение 3 мес в смеси с оксидом алюминия титр клеток штамма Р. aureofaciens ИБ 51 составлял (1,4 ± 0,5) • 108 КОЕ/г, но антагонистическая активность клеток к этому времени уже была утрачена. После 10 месяцев хранения на глиноземе не удалось обнаружить живых клеток штамма (см. табл. 51).
Наиболее эффективным твердым носителем, с точки зрения длительного поддержания жизнеспособности и активности клеток штамма Р. aureofaciens ИБ 51, оказался каолин при весовом соотношении с КЖ, равном 7:3. Численность клеток бактерий оставалась в течение 10 мес на уровне 9,7 ± 0,5 • 106 КОЕ/г, при этом сохранялась фунгистатическая активность клеток в отношении Bipolaris sorokiniana (табл. 51).
Высокий титр культуры (3,4 ± 0,5) • 108 КОЕ/г без утраты антагонистической активности (размер зон подавления роста гриба 10 мм) оставался стабильным в течение 3 мес, что позволило рекомендовать каолин в качестве компонента биопрепарата Елена.
Таким образом, разработаны твердые препаративные формы биопрепаратов Елена и азолен для защиты сельскохозяйственных растений от болезней.
<< | >>
Источник: о.н. логинов. БАКТЕРИИ Pseudomonasи Azotobacter как объектысельскохозяйственнойбиотехнологии. 2005

Еще по теме Разработка твердыхпрепаративных форм биопрепаратов:

  1. Технологическая схема опытно-промышленного производства биопрепаратов
  2. РАЗРАБОТКА ИНФРАСТРУКТУРЫ
  3. Разработка проблем макроэволюции
  4. 2.2.1. Разработка алгоритма диагностики Malassezia-инфекций животных.
  5. Разработка метода, определения остаточных количеств препаратов. 
  6. ПОЧВЕННАЯ ДИАГНОСТИКА ПРИ РАЗРАБОТКЕ СИСТЕМЫ УДОБРЕНИЯ ПЛОДОВЫХ И ЯГОДНЫХ КУЛЬТУР
  7. VI. РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ И МЕТОДОВ ЗАЩИТЫ ЛОШАДЕЙ ОТ ГАСТРОФИЛЕЗА
  8. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИОПЫТНО-ПРОМЫШЛЕННОГОПРОИЗВОДСТВАБИОПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ-АНТАГОНИСТОВ
  9. Разработка биохимических основ учения о питании. Открытие витаминов
  10. ЭВОЛЮЦИЯ ЖИЗНЕННЫХ ФОРМ
  11. 2.4. Определение подвижных форм фосфорав почве
  12. Отбор у агамных форм
  13. Динамика подвижных форм азотистых веществ