<<
>>

ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКАИ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТАБОЛИТОВ,ОБЛАДАЮЩИХ ФУНГИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ,ПРОДУЦИРУЕМЫХ БАКТЕРИЯМИ РОДОВ PSEUDOMONASИ AZOTOBACTER

  Антибиотические вещества псевдомонад, подавляющих развитие различных групп фитопатогенных бактерий и грибов, давно уже являются предметом интенсивных исследований ученых. Несомненно, что способность штамма к синтезу антибиотических веществ во многом определяет активность бактерии-антагониста.

К настоящему времени у бактерий р. Pseudomonas обнаружено около 100 антибиотических веществ самого разнообразного строения и только не более 20% из них играют роль в подавлении фитопатогенных грибов.
Способность к синтезу ациклических антибиотиков широко распространена у псевдомонад. Но с точки зрения подавления фитопатогенных грибов, можно отметить антифунгин, выделенный Худяковым и др. [1965] из культуральной жидкости Р. mycophaga. Он действует на возбудителя вилта хлопчатника Verticillium dahliae, в связи с чем высказывалось мнение о перспективности его применения в борьбе с грибными заболеваниями растений. В дальнейшем выяснилось [Попова и др., 1971], что антифунгин представляет собой комплексный препарат, содержащий смесь уксусной, пропионовой, масляной, валериановой, капроновой и салициловой кислот. Наиболее активным компонентом среды являлась н-капроновая кислота.
Наибольшее количество публикаций посвящено антибиотикам феназиновой группы, их химической структуре, биологической активности, путям синтеза.
Способность к синтезу гетероциклического феназинового ядра является одной из отличительных особенностей метаболизма бактерий р. Pseudomonas. Многие антибиотики-феназины выделены из псевдомонад сравнительно давно.
Один из наиболее ранних антибиотиков - пиоцианин (синий пигмент Р. aeruginosa) выделен в 1860 г. По химическому строению он представляет собой 9-Ы-метил-1-оксифеназин [Knight et al., 1979].
Наряду с пиоцианином в КЖ штаммов Р. aeruginosa были обнаружены и другие пигменты - гемипиоцианин и оксихлорора- фин. Оксихлорорафин является амидом феназин-1-карбоновой кислоты, может быть получен синтетически [Takeda, 1958] из хлорорафина - изумрудно-зеленого пигмента, характерного для Р. chlororaphis, однако выделенного и из КЖ Р. aeruginosa [Kanner et al., 1978].
Было показано, что штаммы Р. aeruginosa, образующие геми- пиоцианин и оксихлорорафин, обладали более высокой антифун- гальной активностью в опытах по антагонизму [Takeda, 1959].
Способность к синтезу феназиновых пигментов свойственна и другим видам р. Pseudomonas. Феназин-1 -карбоновую кислоту способны синтезировать штаммы Р. putida, Р. fluorescens и Р. aeruginosa [Slininger, Shea-Wilbur, 1995; Slininger et al., 1996].
Исследованиям антибиотических свойств штамма Р. fluorescens 2-79, подавляющего развитие Gaeumannomyces graminis var. tritici (Ggt), поражающего пшеницу, посвящены работы M. Weller и L.S. Thomashow [1989, 1990]. Показано, что клетки Р. fluorescens 2-79 продуцируют антибиотик феназин-1-карбоновую кислоту, которая обнаруживалась у растений, выросших из семян, обработанных культурой псевдомонады [Thomashow et al., 1990], она также входит наряду с наиболее сильным антибиотиком 2-оксифеназин-1-карбоновой кислотой и 2-оксифеназином в состав пигментного комплекса Р. aureofaciens [Петренко, Боровков, 1970; Toohey et al., 1965].
Широкое распространение феназиновых пигментов у бактерий р.
Pseudomonas, высокая активность их биосинтеза свидетельствуют о важной и пока окончательно не выясненной роли их в жизнедеятельности бактерий-продуцентов [Pierson L.S.P., Ш, Pierson Е.А., 1996; Chin-A-Woeng et al., 2003].
Комплекс антибиотиков ароматической природы был выделен из штаммов Р. aurantiaca [Киприанова и др., 1969, 1971] и параллельно из Р. fluorescens [Редди, Боровков, 1969], компоненты комплекса имели близкий химический состав, сходные УФ- и ИК-спектры [Есипов и др., 1975]. После разделения компонентов комплекса антибиотически высокоактивным веществом оказался 2,4-диацетилфлороглюцин. Этот антибиотик наряду с фенази- нами является одним из всесторонне изучаемых [Shanahan et al., 1992; Nowak-Thompson et al., 1994; Bonsall et al., 1997]. Это, по-ви- димому, обусловливается способностью Pseudomonas к образованию сложных многоядерных производных из более простых путем конденсации с помощью формальдегида подобно тому, как это происходит в химическом синтезе.
Можно отметить, что антибиотики ароматической природы встречаются у псевдомонад сравнительно редко [Смирнов и др., 1991; Nowak-Thompson et al., 1994], чего нельзя сказать о способности к синтезу азотсодержащих гетероциклических соединений.
К числу соединений, содержащих пиррольное ядро, относится антибиотик пиолютеорин, впервые выделенный из Р. aeruginosa [Takeda, 1959], но чаще всего встречающийся у Р. fluorescens [Mauerhofer et al., 1994].
Еще одно производное пиррола - пирролнитрин - является одним из самых мощных антифунгальных агентов, выделенных из бактерий р. Pseudomonas. Пирролнитрин впервые был выделен из КЖ Р. pyrrocynia [Arima et al., 1964]. Позже D. Livelly и др. [1966] пирролнитрин был обнаружен в КЖ Р. aureofaciens. В дальнейшем пирролнитрин был обнаружен и у других видов псевдомонад: Р. fluorescens, Р. cepacia [Burkhead et al., 1994].
В работе C.R. Howell, R.D. Stipanovic [1980] показано, что штамм P. fluorescens Pf-5 синтезировал два антибиотика - пирролнитрин и пиолютеорин.
Изолят Р. cepacia RB425 продуцировал ряд антибиотиков, которые оказались близкими пирролнитрину, 2-(2-гептенил)-3-ме- тил-4-хинолинолу и 2-(2-ноненил)-3-метил-4-хинолинолу. Обнаружена высокая активность очищенных соединений в отношении Pyricularia oryzae, Rhizoctonia solani, Verticillium dahliae. В то же время бактерицидная активность выделенного штамма была низкой [Homma et al., 1989].
Новые хлорированные фенилпиррольные антибиотики, выделяемые бактерией Р. cepacia, получены W.J. Janisiewicz, J. Roitman [1988]. Они представляли собой 2,3-дихлор-4-(2-амино- хлорфенил)-пиррол и 2-(2-гептенил)-3-метил-4(1Н)-хинолинон [Roitman et al., 1990]. Из другого штамма Р. cepacia RB425 были выделены антибиотики, близкие по строению к пирролнитри- ну, 2-(2-гептенил)-3-метил-4-хинолину и 2-(2-ноненил)-3-метил- хинолину [Roitman et al., 1990]; из штамма Р. cepacia PC II были выделены 2-пентил-3-метил-4-хинолинон, 2-гептил-З-ме- тил-4-хинолинон, 2-нонил-3-метил-4-хинолинон [Moon et al., 1996].
В 1981 г. К. Kintaka и др. сообщили о выделении из бактерий р. Pseudomonas антибиотика р-лактамной природы. Продуцент нового антибиотика сульфазецеина получил название Р. aci- dophila. Отличительной особенностью этого вида является способность к росту при низких значениях pH, что крайне редко встречается у псевдомонад. Сульфазецеин - водорастворимый антибиотик, содержащий серу, аланин, глутаминовую кислоту и представляющий собой 3(К)-Зу^-глютамин-амино-3-метокси- азетидин-2он-сульфоновую кислоту, позже было показано, что этот антибиотик обладает антифунгальной активностью.
Т. Paulitz и др. [2000] выделили из КЖ штамма Р. aureofaciens ( = Р. chlororaphis) 63-28 антибиотик бутиролактонной (фура- новой) природы - 3-(1-гексенил)-5-метил-2-(5Н)-фуранон или (г)-4-метил-2-(1-гексенил)-2-бутенолид , ранее у этого штамма были выделены еще два бутиролактона с антифунгальными свойствами - (г)-4-гидрокси-4-метил-2-(1-гексенил)-2-бутенолид и (Z)-4- гидроксиметил-2-(1-гексенил)-2-бутенолид [Gamard et al., 1997].
Новый антибиотик, обладающий фунгицидными свойствами, выделен у штамма Pseudomonas sp. Q38009 и представляет собой 15-членное макролактоновое кольцо с ответвлением метоксии- минной структуры [Suzumura et al., 1997].
Считалось, что способность к синтезу антибиотиков - полипептидов - у бактерий р. Pseudomonas распространена сравнительно слабо [Parker et al., 1984], но в последнее время это утверждение было опровергнуто.
У Р. cepacia АТСС 39277 обнаружена целая группа циклических пептидов, проявляющих антигрибные свойства, - ксилокан- дины Al, А2, Bl, В2, Cl, С2, D1 и D2 [Bisacchi et al., 1987; Meyers et al., 1987]. При помощи масс-спектрометрии определены их молекулярные массы (кДа): А1 - 1,215; А2 - 1,199; В1 - 1,229; В2 - 1,213; С1 - 1,097; С2 - 1,081; D1 - 1,083; D2 - 1,067. Каждый кси- локандин содержит глицин, серин, аспарагин (1-3 остатка), р-гид- рокситирозин и необычную аминокислоту с формулой C|8H37N05. Дополнительно компоненты Al, А2, D1 и D2 содержат 2,4-диаминобутановую кислоту, компоненты Al, Bl, С1 и D1 - эритро-р-гидроксиаспарагин, а ксилокандины Al, А2, В1 и В2 содержат еще и ксилозу. Для каждой пары ксилокандинов эритро-р-гидроксиаспарагин в первом компоненте пары таким образом заменен аспарагином во втором компоненте, что массовое различие для каждой пары составляет 16 Да.
Из другого штамма Р. cepacia AF 2001 корейскими учеными [Lee, 1994] выделен другой антибиотик пептидной природы - се- пацидин А, обладающий высокой антигрибной активностью и представляющий собой смесь двух очень близких по химической природе компонентов сепацидина А1 и сепацидина А2.
Штамм Р. cepacia ВС И продуцирует антибиотик AFC-BC11, отличающийся высокой антагонистической активностью [Kang et al., 1998].
Ранее отмечалось, что Pseudomonas sp. продуцирует также комплекс полипептидных антибиотиков - эльтерецидинов, подавляющих рост Alternaria [Kirinuki et al., 1977].
В последнее время появились сообщения о циклических ли- попептидах, обладающих фунгицидной активностью, - вискози- намиде, тенсине, амфизине, обнаруженных у Р. fluorescens [Nielsen N. et al., 1998; Nielsen T. et al., 2000], Pseudomonas sp. DSS73 [Sorensen et al., 2001].
W. Fakhouri и др. [2001] выделили из штамма Р. fluorescens G308 новое антибиотическое вещество, идентифицированное как М-меркапто-4-формилкарбостирил.
Из КЖ другого штамма Р. fluorescens ММ-В16 С. Lee и др. [2003] выделили антибиотик аеругин, проявляющий антигриб- ную активность. Эмпирическая формула выделенного соединения C10HuNO2S, молекулярная масса 209,0513, по химической структуре 4-оксиметил-2-(2-оксифенил)-2-тиазолин.
Корейскими учеными во главе с К.К. Kim [2000] выделен другой антифунгальный антибиотик - N-бутилбензенсульфонамид.
Штаммы WH157 и WH161 Р. fluorescens, развивающиеся на семенах, корнях, гипокотилях и семядолях хлопчатника, синтезируют антибиотик оомицин А. Обработка семян хлопчатника штаммом WH157 стимулировала прорастание семян на 15-20% и снижала заражение всходов Pythium ultimum [Howie et al., 1989].
Другой класс антифунгальных метаболитов псевдомонад - это экзоферменты (хитиназы и глюконазы). Так, наличие у некоторых псевдомонад комплекса гидролитических ферментов определяет их способность использовать в качестве источника питания грибной мицелий.
Изучена хитинолитическая активность у 235 изолятов различных видов Pseudomonas, отнесенных к комплексу Р. fluorescens и Xanthomonas maltophilia, близких к Pseudomonas. Способность к образованию хитинолитических ферментов выявлена лишь у отдельных штаммов Pseudomonas, в то время как у большей части штаммов (33 из 41) X. maltophilia хитинолитическая активность обнаружена [Andreeva et al., 1996].
В коллекцию микроорганизмов В КМ депонирован штамм Р. maltophilia ТС-259, обладающий хитинолитической активностью. Данный штамм обладает способностью подавлять рост фитопатогенных грибов-возбудителей сосудистых увяданий и корневых гнилей растений [Пат. РФ 2031119].
Анализ ферментативной активности группы штаммов р. Pseudomonas выявил у штамма SPB2142 способность к продуцированию хитиназы. При изучении антифунгальной активности бактерий подтвердилось, что данный штамм обладает способностью использовать грибной мицелий как источник питания [Кравченко и др., 2002].
На основе Тп 7 была сконструирована система, несущая chiA ген Serratia marcescens под контролем Рис-промотора в составе плазмиды pUXH21. В трехродительском скрещивании pUXH21 была передана в Р. fluorescens, в результате чего получили штамм, стабильно экспрессирующий и секретирующий активную хитиназу. Сконструированный штамм обладал биологической активностью против почвенного растительного патогена Rhizoctonia solani [Simi Body et al., 1994].
Большинство авторов сообщает о способности штаммов Az, chroococcum продуцировать антифунгальные антибиотики, но в литературе практически нет сведений о химической природе этих веществ. В единственном источнике сообщается о штамме Az, chroococcum 92, синтезирующем на среде с мелассой антифун- гальный антибиотик, представляющий собой метиловый эфир алифатической тетраеновой кислоты. Антибиотик угнетал рост фитопатогенных грибов Helminthosporium sativum, Botrytis cinerea, Verticillum dahliae, Fusarium sp. [Пат. 922105]. Из культуральной жидкости штамма Azotobacter chroococcum 53 Е.Н. Мишустиным и др. [1969] был выделен антибиотик, сходный по структуре с анисомицином, но отличающийся от последнего по УФ-спектру, поэтому был сделан вывод о выделении нового антибиотика, ранее не описанного в литературе. Антибиотик угнетал рост фитопатогенных и фитотоксичных грибов родов Aspergilus, Penicillium, Alternaria, Fusarium.
Реже в литературе сообщается о способности бактерий р. Azotobacter продуцировать биологически активные вещества группы сидерофоров, которые подавляют рост фитопатогенов путем конкуренции с ними за железо [Suneja et al., 1993, 1996].
Таким образом, у бактерий р. Pseudomonas в отличие от представителей Azotobacter наиболее широко изучены свойства, характеризующие способность подавлять или замедлять рост почвенных фитопатогенов. Механизмы антагонистических взаимодействий псевдомонад и фитопатогенов различны. Это продукция сидерофоров, отвечающих за связывание и транспорт железа и синтез антибиотических веществ. Нам представлялось наиболее интересным изучить вторичные метаболиты как псевдомонад, так и азотобактера, с точки зрения их антагонистической активности к фитопатогенам. Для этого были апробированы разработанные нами схемы выделения и очистки метаболитов, обладающих фунгицидной активностью.
Широкая распространенность Pseudomonas обеспечивается их способностью развиваться в самых различных условиях в природе, в широком интервале температур и использовать самые разные соединения углерода и азота в энергетическом и конструктивном обмене [Рубан, 1986; Corbell, Loper, 1995]. Но для культивирования Pseudomonas с целью получения антибиотических веществ, как правило, требуются богатые органическими формами азота и углерода среды.
Е.О. King и др. [1954] предложили среду для определения образования флюоресцирующих пигментов; в дальнейшем и до наших дней эта среда Кинг В, в состав которой входят глицерин, пептон, K2HP04, MgS04, является одной из основных для культивирования Pseudomonas - продуцентов веществ с фунгицидной активностью. Реже используются также богатые среды - такие как среда LB и питательные бульоны с добавлением 0,5-1,0% источника углевода (обычно глюкозы) [Katoh, Iton, 1983; Gould et al., 1985; James, Gutterson, 1986]. Однако, как показано в работе Е.И. Квасникова и др. [1975], штаммы Р. aurantiaca способны к синтезу веществ с фунгицидной активностью не только на богатой среде Кинга, но и на синтетической среде Мюнца в присутствии низкомолекулярных н-алканов (С8-С10).
Достаточно хорошо изучен синтез антибиотиков феназино- вой природы на средах, где в качестве единственного источника углерода фигурировал н-алкан, что было показано для пиоциани- на [Поморцева, 1965], феназин-1-карбоновой кислоты (с октадеканом, гексадеканом, тетрадеканом) [Higashihara, Sato, 1969]. Т. Higashihara и A. Sato [1985] получили феназин-1-карбоновую кислоту из штамма Р. aeruginosa, источником углерода для которой служил этанол. Из работы Т. Ohmori и др. [1978] следует, что в значительных количествах синтезируется бактериями на средах с н-парафинами и пиолютеорин.
В.К. Duffy, G. Defago в своих работах [1997, 1999] показали влияние источника углерода и минерального состава питательной среды на биосинтез диацетилфлороглюцина, пиолютеорина, пирролнитрина и сидерофора пиохелина, продуцируемых штаммом P.fluorescens CHAO. Секреция флороглюцина стимулировалась наличием в питательной среде ионов Zn+2, NH4Mo+2 и глюкозы, биосинтез пиолютеорина стимулировался ионами Zn+2, Со*2 и глицерином, но в то же время подавлялся глюкозой, а выход антибиотика пирролнитрина увеличивался на средах с фруктозой, маннитолом в присутствии смеси ионов Zn+2 и NH4Mo+2, синтез же сидерофора пиохелина стимулировался ионами Со*2 и источниками углерода, такими как фруктоза, маннитол и глюкоза. Эти закономерности сохранялись и для других 41 штамма этого вида, менее продуктивных по количеству синтезируемых антибиотиков. В этой работе также показано, что неорганические фосфаты ингибируют синтез флороглицина, а секреция других антибиотиков уменьшается незначительно. Внесение в питательную среду таких ионов, как Cu+, Mn+2, Li+, Fe+2, Mg+2, Са+2, В+3, не играет значительной роли в биосинтезе.
Синтез феназиновых антибиотиков начинается в стационарную фазу роста. На среде с глицерином в качестве источника углерода, лейцином и аланином в качестве источников азота и определенным уровнем содержания магния и фосфора выход фена-









48 ч инкубации. Световая микроскопия. Увел. 400 (а, в, г, д); 1600 (б) а - контроль;
под воздействием метаболитов: б, д - Pseudomonas aureofaciens ИБ 6; в - Pseudomonas sp. ИБ 182; г - Pseudomonas aureofaciens ИБ 51


Рис. 4. Прорастание конидий и формирование мицелия Fusarium culmorum
48 ч инкубации. Световая микроскопия. Увел. 400 (а, в, г, д); 1600 (б)
а - контроль;
под воздействием метаболитов: б, д - Pseudomonas putida ИБ 56; в - Pseudomonas sp. ИБ 182; г - Pseudomonas aureofaciens ИБ 51








Рис. 5. Влияние штаммов азотобактера на развитие микромицета Bipolaris sorokiniana
а - Az. vinelandii ИБ 1; б - Az. vinelandii ИБ 3; в - контроль


Рис. 6. Влияние штаммов азотобактера на развитие микромицета Fusaruim culmorum
а - Az. vinelandii ИБ 1; б - Az. vinelandii ИБ 4; в - контроль







alt="" />
Рис. 13. Пространственная конфигурация молекулы триглицеридпептида псевдомонад



зинов достигает максимальной концентрации [MacDonald, 1967; Leisinger, Margraff, 1979]. Лимитирование фосфатами вызывает синтез феназинов. Низкий уровень фосфатов в конце экспоненциальной фазы является триггером синтеза феназинов. Повышение концентрации фосфатов останавливает синтез [Martin, 1977; Martin et al., 1992].
Большое влияние на синтез антибиотиков оказывает аэрация в процессе культивирования. Как правило, культивирование псевдомонад с целью получения антибиотиков фунгицидной природы проводят в течение 48-72 ч (исключение составляет синтез антибиотика аеругина - 6 сут) [Lee et al., 2003] при температуре 24-28 ° в условиях аэрации. И также, как правило, максимальный рост фунгицидной активности наблюдается в стационарную фазу. 
<< | >>
Источник: о.н. логинов. БАКТЕРИИ Pseudomonasи Azotobacter как объектысельскохозяйственнойбиотехнологии. 2005

Еще по теме ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКАИ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТАБОЛИТОВ,ОБЛАДАЮЩИХ ФУНГИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ,ПРОДУЦИРУЕМЫХ БАКТЕРИЯМИ РОДОВ PSEUDOMONASИ AZOTOBACTER:

  1. Структура и свойства новых метаболитов Pseudomonas и Azotobacter,обладающих фунгицидной активностью
  2. БАКТЕРИИ РОДОВ PSEUDOMONAS И AZOTOBACTER -АНТАГОНИСТЫ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВИ БАКТЕРИЙ
  3. о.н. логинов. БАКТЕРИИ Pseudomonasи Azotobacter как объектысельскохозяйственнойбиотехнологии, 2005
  4. ВЫДЕЛЕНИЕ И ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКАНОВЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙРОДОВ PSEUDOMONAS И AZOTOBACTER -АНТАГОНИСТОВ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ
  5. БАКТЕРИИ РОДОВ PSEUDOMONAS И AZOTOBACTERКАК ПРЕДСТАВИТЕЛИ ГРУППЫ PGPR
  6. ФИКСАЦИЯ АТМОСФЕРНОГО АЗОТА IN VITRO ФЕРМЕНТНЫМИ ПРЕПАРАТАМИ, ВЫДЕЛЕННЫМИ ИЗ КЛУБЕНЬКОВ БОБОВЫХ И ИЗ НЕИНФИЦИРОВАННЫХ БАКТЕРИЯМИ ВЫСШИХ РАСТЕНИ
  7. Характеристика выделенных культур по наличию свойств,положительно влияющих на растение
  8. Концепция пула метаболитов
  9. ТЕРМОДИНАМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СОСТОЯНИЯПОЧВЕННОЙ ВЛАГИ (ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ,АКТИВНОСТЬ ВОДЫ)
  10. 6.3.1. Какими свойствами должны обладать языки-посредники?
  11. КОЛОНИЗАЦИЯ РИЗОСФЕРЫ РАСТЕНИЙБАКТЕРИЯМИ-АНТАГОНИСТАМИ РОДОВPSEUDOMONAS И AZOTOBACTER
  12. Общие закономерности выделения (экскреции) токсикантов из организма
  13. Бактерии