Задать вопрос юристу
 <<
>>

1.5.2. Цитологические и культуральные методы диагностики Malassezia-инфекций

Для получения достоверных результатов как при цитологическом, так и при культуральном исследовании, существенную роль играет способ отбора патологического материала. Известно несколько процедур, используемых для этих целей как в медицинской, так и в ветеринарной практике.

Метод прямого мазка-отпечатка очевидно является наиболее простым и доступным.

Обезжиренное предметное стекло прикладывают на определенное время к очагу поражения, после чего препарат используют для цитологического исследования. Этот метод рекомендуется для применения в повседневной ветеринарной практике [77].

Метод с использованием полосок полимерной пленки («пленочный метод») был предложен впервые J. Wilkler в 1988 году. При этом методе полоску пленки площадью 1 см2 дважды прикладывают к пораженному участку, после чего окрашивают для цитологического исследования, или помещают на поверхность питательной среды для культурального анализа. D. Morris [129] для отбра проб с гладкой кожи использовали полоски целлофана (5x2 см), которые прикладывали к поверхности кожи 2 раза, а затем помещали на поверхность среды Сабуро в каплю оливкового масла. Модификацией данного метода является метод с использованием липкой ленты (скотча). Данный метод применялся в частности A. Nell [96], D. Preziozi [146], М. Pechere [138].

Метод с использованием контактных чашек («бакпечаток») используется в исследованиях R. Bond [34], A. Nell [96], A. Gupta [89]. Небольшие пластиковые чашки, заполненные до краев плотной питательной средой, прикладывают на определенное время к очагу поражения, после чего закрывают крышкой и инкубируют. Данный метод позволяет провести количественный учет численности популяции дрожжей на определенной площади кожи. Помимо удобства в применении, он также является перспективным с точки зрения стандартизации диагностических процедур, т.к. «бакпечатки» выпускаются промышленным способом.

Метод смыва существует в нескольких вариациях, в частности смыв- соскоб (по Williamson-Kligman) и смыв-мазок. В обеих случаях используется трафарет (кольцо), ограничивающий участок кожи определенной площади, который заполняется смывной жидкостью, после чего материал с поверхности кожи отбирается посредством соскоба или мазка ватным тампоном. При сравнительном изучении обеих вариантов N. Keyworth [100] пришел к выводу, что они обладают практически одинаковой чувствительностью, однако метод «смыв-мазок» менее травматичен. Метод позволяет довольно точно определить плотность популяции дрожжей на участке кожи определенной

площади, широко распространен в медицинской микологии, однако малоприменим в ветеринарной практике.

R. Bond [34] для смыва использовал различные составы - Тритон X- 100, Твин-40, Твин-80, и пришли к выводу, что они одинаково подходят для получения суспензии дрожжевых клеток, однако жизнеспособность Malassezia spp. в суспензии существенно снижается уже через два часа. Чувствительность метода смыва была сопоставима с методом контактных чашек.

Отбор материала ватным тампоном-зондом является одним из наиболее распространенных методов отбора материала для культуральных и цитологических исследований [56, 20,65]. Основное его преимущество - возможность отбора проб из труднодоступных участков тела животного - межпальцевых складок, слухового канала; шерстный покров не препятствует отбору.

Некоторые авторы при отборе материала из слухового канала используют специальный стерильный конус, через который вводят тампон-зонд в слуховой канал, что позволяет снизить контаминацию пробы микроорганизмами с ушной раковины [76].

При использовании большинства техник отбора патологического материала пробы в дальнейшем могут быть использованы как для цитологического, так и для культурального исследования. Исключение составляют метод прямого мазка-отпечатка, который используется только при цитологических исследованиях, и метод контактных чашек, применимый только для культу- ральной диагностики.

Среди авторов не существует единого мнения о предпочтительности какого-либо из перечисленных методов отбора патологического материала. R. Kennis [97] провел сравнительное изучение эффективности нескольких диагностических методов: отбор материала с помощью скотча с последующим культуральным анализом; отбор материала методом соскоба, отбор материала ватным тампоном, и метод прямого мазка-отпечатка с последующим цитологическим исследованием. Установлено, что наибольшую чувствитель-

ность проявил культуральный метод с использованием скотча. Цитологическое исследование оказалось менее чувствительным, причем метод отбора материала для исследования не оказывал существенного влияния на результаты.

По мнению N. McEwan [124] оптимальными методами отбора материала являются метод с использованием липкой ленты и метод вычесывания шерсти зубной щеткой по МакКензи (MacKenzie).

A. Omodo-Eluk [135] сообщает, что при отборе материала ватным тампоном дрожжи рода Malassezia были обнаружены на коже у 53% собак при культуральном исследовании и у 32% - при цитологическом. При отборе материала с помощью липкой ленты эти показатели составили 80% и 43% соответственно. Автор отмечают преимущества отбора материала с помощью скотча и культурального метода исследования по сравнению с цитологическим.

Пробы, отобранные для культурального исследования, необходимо доставлять в лабораторию в максимально сжатые сроки. F. Bernardo [29] делал высевы материала с ватных тампонов-зондов не позднее 2 часов после отбора.

Резюмируя вышеизложенное, отметим положительные и отрицательные стороны различных методов отбора патматериала для диагностических исследований на наличие Malassezia-mi§Qmw.Vi. Кожный соскоб связан с травмированием кожи и не позволяет точно оценить плотность популяции Malassezia spp. в очаге поражения. Метод смыва наоборот пригоден для оценки плотности популяции на определенной площади кожного покрова, однако он требует выстригания шерсти и не пригоден для труднодоступных участков тела. Аналогичные свойства у метода с использованием пленки (скотча). Метод контактных чашек (бакпечаток) отличается практичностью, удобством в применении и возможностью количественного учета дрожжей, однако тоже не применим для труднодоступных участков тела.

Очевидно, наибольшей универсальностью обладает метод с использованием ватных тампонов-зондов. Они пригодны как для отбора материала с гладкой кожи, так и из слухового прохода, межпальцевых пространств, кожных складок. Использование промышленно изготавливаемых стерильных ватных тампонов-зондов позволяет стандартизовать процедуру диагностики Malassezia-инфекций, что обеспечит получение достоверных воспроизводимых результатов.

Вопрос условий транспортировки патматериала для последующей куль- туральной диагностики к сожалению весьма поверхностно освещен в доступной литературе. Исходя из общемикологической практики, патматериал (за исключением волос и кожных чешуек) должен быть исследован в течение часа после доставки или через 3 часа при хранении в холодильнике при +4°С [1]. Однако, в повседневой лабораторной парктике не всегда удется соблюсти эти условия.

В жидких образцах, полученных методом смыва с применением различных детергентов, жизнеспособность Malassezia spp. резко снижается уже через 2-3 часа. Сухие образцы (на пленке, на ватных тампонах-зондах, соскобы) также должны исследоваться как можно скорее, т.к. низкая влажность губительна для дрожжевых грибов. Использование для транспортировки жидких питательных сред напротив создает предпосылки для размножения как дрожжей, так и сопутствующей бактериальной и грибной микрофлоры. Таким образом, эти способы не обеспечивают длительную сохранность в материале грибов рода Malassezia, что ограничивает их использование в повседневной ветеринарной практике.

В подавляющем большинстве изученных нами литературных источников не упоминается об использовании микробиологических транспортных сред, которые бы обеспечивали длительную сохранность Malassezia spp. в образце патологического материала. G. Fernandez [76] для транспортировки образцов успешно применял коммерческую транспортную систему BBL Cul-

ture Swabtm Transport media, однако авторы не расшифровывают состав транспортной среды, а также сроки, в течение которых клетки Malassezia spp. оставались жизнеспособными.

Приведенные данные указывают на актуальность дальнейших изысканий практичных и доступных методов отбора и транспортировки патологического материала при диагностике Мз/огсегш-инфекций.

Цитологическое исследование при диагностике Ма/о^еяш-инфекций обычно включает фиксацию препарата над пламенем, его окраску и микроскопию как в сухой, так и в иммерсионной системе микроскопа.

Для обнаружения клеток Malassezia может быть использовано несколько методов окраски. A. Kligman [102] для выявления Malassezia spp. и других патогенных грибов использовали окраску по Хотчкинсу-МакМанусу (Hotch- kins-McManus), известную также как метод с реагентом Шиффа. Данный метод достаточно трудоемок и требует большого количества реагентов, однако он высокочувствителен и позволяет легко обнаруживать в тканях большинство видов патогенных грибов, в т.ч. образующих капсулу.

Окраска метиленовым синим и окраска чернилами Паркера (Parker ink) также используется для детекции грибов рода Malassezia. По данным L. Xiong [171], частота обнаружения Malassezia spp. при использовании этих методов существенно не отличается и составляет 96% при окраске метиленовым синим и 94% при окраске чернилами Паркера. Однако окраска метиленовым синим, в отличии от окраски чернилами, достаточно чувствительна и для обнаружения других дрожжевых грибов, в частности Candida spp.

М. Crespo [56] в своих исследованиях применяли окраску по Грамму. А. Padilha-Goncalves [136] успешно использовал окраску лактофеноловым синим.

Большинство зарубежных авторов используют окраску Diff-Quik, являющуюся модифицированным методом Райта (Wright), и выпускаемую промышленным способом (Dade Behring, Deerfield, IL, USA; Baxter Diagnos-

tics AG, Dudingen, Switzerland). При этом способе клетки гриба окрашиваются в сине-фиолетовый, реже в красно-розовый цвет. По форме клетки как правило овальные, или в форме «отпечатка стопы» или «земляного ореха». Еще одним коммерческим красителем, применяемым для выявления Malassezia, является Hemacolor ® [53].

L. Cornegliani [53] рекомендует окраску кристалл-виолетом. По данным авторов, при этом методе дрожжевые клетки окрашиваются интенсивно и практически моментально, а чувствительность метода сопоставима с таковой при использовании Diff-Quik.

Микроскопию проводят при увеличении хЮОО в иммерсионной системе или в сухой системе при увеличении х400.

Для оценки численности популяции грибов рода Malassezia не существует стандартных общепринятых показателей. Так, D. Perrine отмечает, что диагностическое значение имеет обнаружение в препарате даже одной дрожжевой клетки. R. Rosychuk [154] считает, что в норме при микроскопии с иммерсией должны обнаруживаться лишь случайные, единичные клетки.

По мнению F. Rausch [150], диагностическое значение имеет только обнаружение более 10 дрожжевых клеток в поле зрения при х400, что соответствует примерно 4 клеткам при микроскопии с иммерсией. Аналогичный критерий использовал G. Fernandes [76]. По данным этого автора, у 33,3% здоровых и 30,2% больных отитом собак клетки Malassezia spp. не обнаруживались; у 40,0% здоровых и 28,3% больных собак содержание клеток не превышало 4 в поле зрения при микроскопии с иммерсией, и у 26,6% здоровых и 41,5% больных животных обнаружено более 4 клеток.

С. Reme сообщает, что в слуховом канале здоровых собак количество клеток Malassezia при микроскопии с иммерсией только в 4% превышало 4 клетки в поле зрения. У 50% животных этот показатель составлял 01,-1,3 клетки, у 28% дрожжи не обнаруживались, у 18% животных обнаруживали 1,5-3,5 клеток. На основании полученных результатов автор предполагает,

что в норме обнаружение клеток Malassezia не должно превышать 3,5 клетки в поле зрения при микроскопии с иммерсией (хЮОО) или 10 клеток при увеличении х400.

Foster А. [77] считает популяцию дрожжей повышенной, если наблюдается 5 и более клеток в поле зрения при х400. Такого же мнения придерживаются J. Angus [17], J. Beck et al. [25].

D. Morris et al. [129] считают максимально допустимым количеством 1 клетку в мазках с кожи и 5 клеток в мазках из ушного канала в одном поле зрения при микроскопии с иммерсией.

М. Crespo et al. [56] сообщают, что количество дрожжевых клеток в пробах от собак, больных отитом, при увеличении 400х составляло в 43,8% менее 10 клеток в поле зрения; в 24,6%) - более 10 клеток.

P. Ginel et al. [22] приводят данные о корреляции интенсивности клинических признаков отита с численностью популяции дрожжей в очаге поражения. У больных собак обнаруживали 5 и более дрожжевых клеток в поле зрения при х400, у больных кошек - 12 и более клеток. При этом только у 2-х из 37 здоровых собак было обнаружено более 5 клеток в поле зрения. У 23 из 32 здоровых кошек клетки Malassezia spp. обнаружить не удалось.

J. Beck et al. [25] у собак с гнойным отитом обнаруживали в среднем 12 клеток в поле зрения при х400, у собак с эритематозным и эруминозным отитом - 13 клеток, у собак с церуминозным отитом - 9, у собак к эритематозным отитом - 2 клетки.

Таким образом, среди авторов нет единого мнения, какое содержание клеток Malassezia на кожном покрове считать нормальным или повышенным. Кроме того, при цитологическом исследовании содержание дрожжевых клеток в разных полях зрения в одном и том же препарате может существенно колебаться, что снижает репрезентативность получаемых данных.

Гистологические методы диагностики Мя/а&уегш-инфекций в клинической практике используются существенно реже. Как правило, при изготовле-

нии препарата большая часть дрожжевых клеток теряется, что искажает результаты исследования. D. Pin [139] для окрашивания гистосрезов использовал гематоксилин-эозин и сафранин, что позволяло обнаружить почкующиеся дрожжевые клетки.

По сравнению с цитологическими, культуральные методы позволяют более точно оценить численность популяции дрожжей в очаге поражения, однако нет единого мнения, какую численность популяции считать патологической. К сожалению, сравнительной оценке плотности популяции Malassezia spp. у здоровых и больных животных культуральными методами посвящены единичные публикации. Так, С. Cafarcia et al. [45] сообщают, что у собак, больных отитом, плотность популяции Malassezia spp. в слуховом канале составляла 66,0 КОЕ в образце, у кошек — 59,6 КОЕ. По данным R. Bond [39], на коже здоровых собак в области паха и подкрыльцовой ямки

о

плотность популяции Malassezia spp. составляет менее 1 КОЕ на см .

Мнения различных авторов расходятся в оценке чувствительности и специфичности цитологических и культуральных методов. D. Morris [128] считает цитологический метод диагностики наиболее практичным и достаточно информативным для повседневной ветеринарной практики. По данным М. Crespo et al. [56], частота обнаружения грибов рода Malassezia была идентичной при цитологическом и культуральном анализе, и составила в обеих случаях 68,4%. В другом исследовании частота обнаружения Malassezia-spp. культуральным методом составила 21,2%, цитологическим — 15,1% [58].

По данным A. Kumar et al. [103], частота обнаружения Malassezia spp. у здоровых собак составила 39,4% при цитологическом анализе и 45,4% - при культуральном. Однако у больных животных дрожжи обнаруживались с одинаковой частотой (82,1%) и при цитологическом, и при культуральном методе исследования.

Bensignor Е. et al. [52] при сравнительном изучении цитологического метода с использованием липкой ленты и культурального метода контактных

чашек со средой Диксона пришли к выводу, что чувствительность культурального метода существенно выше, однако для оценки плотности популяции Malassezia spp. лучше подходит цитологический метод.

С. Cafarchia et al. [46] сообщают о бесспорном преимуществе культурального метода диагностики и предлагают использовать его в качестве «золотого стандарта». По представленным данным, цитологический метод проявил высокую специфичность (95%), однако крайне низкую чувствительность (лишь 30%).

J. Angus [17] считает наиболее достоверным комбинированное применение цитологического и культурального исследования.

Резюмируя сведения о различных диагностических методах при Malassezia-иифвкцшх можно сделать вывод, что большинством авторов отдается предпочтение культуральным методам диагностики. Они несколько более трудоемкие, нежели цитологические, однако обладают более высокой чувствительностью, позволяют провести видовую идентификацию изолята и определить его чувствительность к антифунгальным препаратам. Последнее обстоятельство имеет большое практическое значение, т.к. чувствительность грибов рода Malassezia к различным антифунгальным препаратам может существенно варьировать [88].

<< | >>
Источник: Ершов Петр Петрович. Этиологическая значимость дрожжевых грибов рода Malassezia при кожных заболеваниях животных. Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Москва - 2008. {original}

Еще по теме 1.5.2. Цитологические и культуральные методы диагностики Malassezia-инфекций:

  1. 1.5. Методы диагностики Malassezia-инфекций животных
  2. 2.2.1. Разработка алгоритма диагностики Malassezia-инфекций животных.
  3. 1.3.1. Патогенез Malassezia-инфекций
  4. 1.3.2. Клинические формы Malassezia-инфекций животных
  5. 2.2.2.1. Изучение распространенности и этиологической структуры Malassezia-инфекций среди собак и кошек
  6. 2.2.2. Изучение клинико-эиизоотологических особенностей Malassezia- инфекций домашних животных в Московском регионе
  7. 2.2.1.1. Сравнительная оценка методов выявления грибов рода Malassezia на покровных тканях животных
  8. 1.3.3. Видовой состав возбудителей Malassezia-инфекций и их распространенность у животных различных видов
  9. ГЕЛЬМИНТОЛАРВОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ
  10. ЗНАЧЕНИЕ НОВЫХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ
  11.   И. П. Кондрахин.   Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник — М.: Колос,. — 520 с., 2004
  12. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ И МЕРЫ БОРЬБЫ С ВИРУСНЫМИ И МИКОПЛАЗМЕННЫМИ БОЛЕЗНЯМИ, ПЕРЕНОСЧИКИ ВИРУСОВ И МИКОПЛАЗМ
  13. Цитологические основы наследственности
  14. Исследование процессавыделения биомассы микроорганизмовиз культуральной жидкости
  15. Изучение культуральных свойств выделенного патологического материала.
  16. 1.3. Грибы рода Malassezia как возбудители инфекционных заболеваний животных.
  17. 1.1. Общая характеристика рода Malassezia Baillon
  18. 2.2.1.2. Изучение частоты встречаемости и плотности популяции грибов рода Malassezia в слуховом канале клинически здоровых животных