<<
>>

2.2.1.1. Сравнительная оценка методов выявления грибов рода Malassezia на покровных тканях животных

В ходе исследования было апробировано несколько методов отбора патологического материала, используемых в ветеринарной микологии: 1) кожный соскоб с пораженного участка; 2) смыва; 3) контактных чашек («бакпе-

чаток»), 4) отбор пробы сухим ватным тампоном-зондом в стерильную пробирку; 5) отбор пробы с помощью коммерческого коллектора, включающего ватный тампон-зонд и пробирку с транспортной средой Эймса.

Результаты сравнительной оценки различных методов отбора патологического материала для выявления грибов рода Malassezia

Табл. 1 № Метод отбора проб Соответствие предъявляемым требованиям 1 Кожный соскоб Классический микологический метод, не требующий специфического инструментария. Отбор проб из труднодоступных участков тела затруднен. Количественная оценка плотности популяции дрожжевых грибов невозможна. Требует скорейшего начала культурального анализа после отбора пробы 2 Метод смыва Трудоемкий метод, требующий специфический инструментарий. Отбор проб из труднодоступных участков тела невозможен. Метод позволяет проводить оценку плотности популяции дрожжевых грибов. Требует скорейшего начала культурального анализа после отбора пробы 3 Метод контактных чашек («бакпечаток») Практичный и удобный метод, однако, требует наличие специфического инструментария. Отбор проб из труднодоступных участков тела невозможен. Метод позволяет проводить оценку плотности популяции дрожжевых грибов. Отбор пробы совмещен с началом культурального анализа 4 Метод липкой ленты Экспресс-метод для цитологических исследований при Malassezia-инфекциях. Метод доступный, однако его чувствительность низкая, он не позволяет проводить культуральное исследование 5 Ватный тампон- зонд Удобный и доступный метод. Позволяет проводить отбор проб из труднодоступных участков тела. Позволяет проводить оценку плотности популяции дрожжевых грибов. Жизнеспособность Апробация методов проводилась на 27 собаках, подозреваемых на наличие Malassezia-инфекций как в форме кожных поражений (дерматитов), так и в форме отитов. Методы оценивали по следующим критериям: - удобство, доступность, необходимость в специфическом инструментарии; - возможность отбора проб из труднодоступных участков тела животного; - возможность последующего количественного учета грибных колоний в образце; - сохранность (жизнеспособность) грибных клеток в образце. Результаты сравнительной апробации данных методов с точки зрения их пригодности для выявления грибов рода Malassezia представлены в таблице 1.

дрожжевых грибов в пробах требует дальнейшего изучения 6. Коллектор с тампоном- зондом и транспортной средой Удобный и доступный метод. Позволяет проводить отбор проб из труднодоступных участков тела. Позволяет проводить оценку плотности популяции дрожжевых грибов. Жизнеспособность дрожжевых грибов в пробах требует дальнейшего изучения Сравнительная апробация данных методов отбора патологического материала показала, что оптимальным для повседневного использования в ветеринарной практике является метод с использованием ватного тампона- зонда (сухого или с транспортной средой). Использование тампона-зонда удобно, позволяет проводить отбор проб из труднодоступных участков тела (в т.ч. из слухового канала), а при посевах проб на питательные среды возможна количественная оценка плотности популяции дрожжевых грибов. Кроме того, использование тампонов-зондов, изготовляемых промышленным способом, позволяет стандартизовать процедуру отбора патологического материала, что обеспечивает воспроизводимость и сопоставимость результатов микологического анализа.

С целью подбора оптимальной питательной среды для культивирования грибов рода Malassezia было проведено сравнительное изучение жизнеспособности 5 эпизоотических штаммов М.

pachydermatis на различных питательных средах. Для посева готовили взвеси дрожжевых культур в физиологическом растворе и определяли концентрацию дрожжевых клеток в камере Горяева. Концентрация дрожжевых клеток у всех пяти культур была приведена к одинаковому значению - 50 млн. клеток в 1 см3. Посев проводили методом десятичных разведений с последующим подсчетом выросших колоний, что позволяло определить жизнеспособность культур грибов на различных питательных средах.

Были использованы наиболее доступные и распространенные микологические питательные среды: сусло-агар, среда Сабуро, среда Чапека; сусло- агар с добавлением селективной антибактериальной добавки хлорамфеникол, специализированные липид-содержащие питательные среды Барфатини и Диксона, а также среда ПД-2. Культивирование посевов проводили при 36°С,

т.к. эта температура многими авторами признана оптимальной для роста грибов рода Malassezia [59, 66, 76]. Наблюдение за посевами проводили ежедневно, визуально отмечая начало роста грибных колоний.

Жизнеспособность эпизоотических штаммов М. pachydermatis на различных питательных средах

Табл. 2 Питательная среда № штамма М. pachydermatis М/а 12803 15003 15503 16103 16903 Барфатини млн/см3 36,0±1,7 41,0±3,3 39,0±1,3 33,0±4,7 37,0±0,7 37,7/3,03 С.ж.к. 72,0±2,4 82,0±7,6 78,0±3,6 67,0±7,4 74,0±0,4 74,4 Начало роста, сут. 2 1 1 2 2 Сусло-агар млн/см3 17,0±1,6 22,0±3,4 20,0±1,4 15,0±3,6 19,0±0,4 18,6/2,70 С.ж.к. 34,0±3,2 44,0±6,8 40,0±2,8 30,0±7,2 38,0±0,8 37,2 Начало роста, сут. 3 3 3 3 3 Сабуро млн/см-1 16,0±3,4 24,0±4,6 21,0±1,6 16,0±3,4 20,0±0,6 19,4/3,43 С.ж.к. 32,0±6,8 48,0±9,2 42,0±3,2 32,0±6,8 40,0±1,2 38,8 Начало роста, сут. 3 3 3 3 3 Сусло-агар + Хлф млн/см3 9,0±2,2 14,0±2,8 13,0±1,8 8,0±3,2 12,0±0,8 11,2/2,58 С.ж.к. 18,0±4,4 28,0±5,6 26,0±3,6 16,0±6,4 24,0±1,6 22,4 4 4 4 4 4 Диксона млн/см3 34,0±1,6 40,0±4,4 38,0±2,4 30,0±5,б 36,0±0,4 35,6/3,84 С.ж.к. 68,0±3,2 80,0±8,8 76,0±4,8 60,0±11,2 72,0±0,8 71,2 Начало роста, сут. 2 1 1 2 2 ПД-2 млн/см1* 20,0±1,8 25,0±3,2 24,0±2,2 17,0±4,8 / 23,0±1,2 21,8/3,27 С.ж.к. 40,0±3,6 50,0±6,4 48,0±4,4 34,0±9,6 46,0±2,4 43,6 Начало роста, сут. 3 3 3 3 3 Чапека Роста нет Роста нет Роста нет Роста нет Роста нет Примечание: «с.ж.к.» - содержание жизнеспособных клеток относительно общей концентрации клеток гриба; Млн./см3 - общая концентрация дрожжевых клеток; М - средняя арифметическая вариационного ряда; а - стандартное отклонение вариационного ряда.

Как показывают представленные данные, наибольшую жизнеспособность культур М. pachydermatis обеспечивали липид-содержащие питательные среды Барфатини и Диксона (соответственно 67,0±7,4% - 82,0±7,6% и

Результаты определения жизнеспособности эпизоотических штаммов М. pachydermatis на различных питательных средах представлены в таблице 2.

60,0±11,2% - 80,0±8,8% жизнеспособных клеток). При этом показатели жизнеспособности М. pachydermatis на среде Барфатини и среде Диксона статистически не отличались (7^=0,008 при tcm=2,131).

Жизнеспособность М. pachydermatis на средах без липидов была статистически ниже, нежели на липид-содержащих средах. На среде Сабуро она составила 32,0±6,8% - 48,0±9,2% 0^=3,43 при fcm=2,13), на сусло-агаре 30,0±7,2% - 44,0±6,8% (fy,=9,01 при tcm=2,13). Показатели жизнеспособности М. pachydermatis на среде Сабуро и сусло-агаре статистически не отличались (^=0,08 при /с„г=2,13). Однако на среде ПД-2 жизнеспособность М. pachydermatis составляла 34,0±9,6% - 50,0±6,4%, что статистически сопоставимо с уровнем жизнеспособности на среде Барфатини (^=1,35 при /см=2,13).

Жизнеспособность культур М. pachydermatis сусло-агаре с добавлением хлорамфеникола составила 16,0±6,4% - 28,0±5,6% и была статистически ниже, нежели на сусло-агаре без селективной добавки (t(p=3,57 при /ст=2ДЗ).

Среда Чапека оказалась непригодной для культивирования М. pachydermatis.

Наиболее быстрое начало роста культур М. pachydermatis отмечали также на липид-содержащих средах Барфатини и Диксона - визуально рост колоний на этих средах наблюдали уже на 2-е сутки, а у отдельных штаммов - спустя 24 ч. после посева. На средах без источников липидов (сусло-агар, среда Сабуро, ПД-2), выраженный рост у всех штаммов отмечали на 3-е сут., а на среде с хлорамфениколом — только на 4-е сут. Морфологические признаки колоний (форма, цвет, рельеф, характер поверхности, строение растущего края) становились отчетливыми на 4-5-е сут. на липид-содержащих средах и на 6-7 сут. на средах без источников липидов.

Исходя из полученных результатов, в дальнейшем для выделения грибов рода Malassezia из патологического материала была использована среда Барфатини, являющаяся липид-содержащией модификацией среды Сабуро. В отличии от среды Диксона, таюке проявившей высокие ростовые свойства

для М. pachydermatis, среда Барфатини более доступна и проста в приготовлении, что делает ее более предпочтительной для повседневной лабораторной диагностики.

Однако недостатком данной среды является возможность роста конта- минантов, прежде всего бактериальных, что может исказить результаты микологического исследования. С этой точки зрения для посевов патматериала целесообразно наряду со средой Барфатини использовать питательную среду с антибактериальной добавкой - в частности, сусло-агар с хлорамфениколом. При количественном учете колоний грибов на этой среде следует учитывать, что жизнеспособность М. pachydermatis на ней в среднем на 52,0% ниже, нежели на среде Барфатини.

В повседневной лабораторной практике большое влияние на объективность микологического анализа оказывают условия и сроки хранения патологического материала. При этом далеко не всегда имеется возможность приступить к культуральному исследованию образцов непосредственно после их отбора. Исходя из этого, была поставлена задача определить сроки, в течение которых жизнеспособность грибов рода Malassezia в образцах патматериала остается стабильной.

Пробы патологического материала отбирали с помощью ватного тампона-зонда в сухой коллектор и коллектор с транспортной средой Эймса. Отбор проб проводили от одного и того же животного с заведомым диагнозом Malassezia-отит. Было одновременно отобрано 5 проб в сухой коллектор и 5 проб в коллектор с транспортной средой Эймса, с соблюдением одинаковой методики отбора. Пробы хранились в холодильнике при 5-8°С, через определенные промежутки времени проводили высев образцов на питательную среду Барфатини с последующим учетом выросших колоний грибов рода Malassezia.

160 и

Результаты определения жизнеспособности Malassezia spp. в образцах патматериала, хранившихся в сухом коллекторе и в коллекторе с транспортной средой Эймса в течение 1, 2, 3, 5, и 7 сут. (рис. 1.)

0 Ч 1 1 1 1 1

исх. 12 3 7

срок хранения, суг.

—Сухой коллектор —с— Коллектор со средой Эймса

Рис. 1. Жизнеспособность грибов рода Malassezia в образцах патологического материала при различных условиях хранения

Установлено, что жизнеспособность Malassezia spp в образцах патматериала, хранившихся в коллекторах с транспортной средой Эймса, статистически не изменялась в течение всего срока хранения (^=0,07 при 4т=2ДЗ) и составляла 143,1±7,8 КОЕ, или 104,4±5,7%.

В образцах, хранившихся в сухих коллекторах, жизнеспособность Malassezia spp сохранялась на исходном уровне в течение первых 2 сут. (93,4% и 97,9% от исходного значения), однако уже на 3-е сутки количество жизнеспособных дрожжевых клеток сократилось до 87,6 КОЕ, что составило 61,2% от исходного количества. На 7-е сут. из образцов было выделено лишь 16,3 КОЕ грибов (11,3%).

Таким образом, в условиях повседневной диагностической практики для отбора патматериала целесообразно использовать коллекторы с транспортной средой Эймса, обеспечивающие сохранность Malassezia spp. в образцах в течение длительного срока. При отсутствии коллекторов с транспортной средой, тампоны-зонды можно хранить в сухих коллекторах или лабораторных пробирках с пробкой, но в этом случае культуральный анализ необходимо провести в течение 2 сут. после отбора образцов патматериала.

В результате проведенных исследований был разработан алгоритм выявления грибов рода Malassezia в организме животных, оптимизированный для применения в повседневной диагностической практике.

животных

Предложенный алгоритм включает: 1. Отбор патологического материала с помощью ватного тампона-зонда с транспортной средой Эймса; 2. Посев патологического материала на питательные среды — Барфатини и Сабуро с хлорамфениколом; 3. Культивирование посевов в течение 5-7 сут. при 36°С; 4. При наличии роста грибов рода Malassezia - количественный учет выросших колоний (см. рис. 2). Полученные результаты позволили перейти к следующим этапам исследования.

<< | >>
Источник: Ершов Петр Петрович. Этиологическая значимость дрожжевых грибов рода Malassezia при кожных заболеваниях животных. Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Москва - 2008.

Еще по теме 2.2.1.1. Сравнительная оценка методов выявления грибов рода Malassezia на покровных тканях животных:

  1. 2.2.1.2. Изучение частоты встречаемости и плотности популяции грибов рода Malassezia в слуховом канале клинически здоровых животных
  2. 2.2.1.3. Изучение частоты встречаемости и плотности популяции грибов рода Malassezia в слуховом канале животных с проявлениями отитов
  3. 1.4. Питательные потребности грибов рода Malassezia и условия для их культивирования
  4. Видовая идентификация грибов рода Malassezia.
  5. Изучение ассимилятивных свойств грибов рода Malassezia по М. Crespo [58].
  6. 1.5.1. Видовая идентификация и биологические особенности грибов рода Malassezia
  7. Ершов Петр Петрович. Этиологическая значимость дрожжевых грибов рода Malassezia при кожных заболеваниях животных. Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Москва - 2008,
  8. Изучение ферментативных свойств грибов рода Malassezia.
  9. 1.3. Грибы рода Malassezia как возбудители инфекционных заболеваний животных.
  10. 1.2. Грибы рода Malassezia как представители нормальной микобиоты кожного покрова животных.
  11. 1.5. Методы диагностики Malassezia-инфекций животных
  12. Глава 6 МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕЛЬМИНТИКОВ В ОРГАНАХ И ТКАНЯХ ЖИВОТНЫХ
  13. 1.1. Общая характеристика рода Malassezia Baillon
  14. 2.4.2. Сравнительная характеристика обучения животных методом «проб и ошибок» в исследованиях Торндайка
  15.   Определение свинца в органах и тканях животных посредством ААС (по В. В. Устенко, 1980). Метод утвержден отделением ветеринарии ВАСХНИЛ, 1980.  
  16. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ВОДНОГО РЕЖИМАЗАБОЛОЧЕННЫХ ЕЛЬНИКОВ
  17. 2.2.1. Разработка алгоритма диагностики Malassezia-инфекций животных.
  18. Методы выявления резистентности гельминтов к антигельминтикам