Задать вопрос юристу

ИЗУЧЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ УСТОЙЧИВОСТИ ХЛОПЧАТНИКА К ВОЗБУДИТЕЛЮ ВЕРТПЦИЛЛЕЗНОГО УВЯДАНИЯ


П. П. ГУСЕВА, Е. Г. С АЛЬ КОВ А,
О.              Л. ОЗЕРЕЦКОВСКАЯ
Всесоюзный институт защиты растений, Институт биохимии им. А. Н. Баха АН СССР
Задачей настоящих исследований являлось выяснение роли пектолитпческих ферментов и фенольных соединении в устойчивости хлопчатника к возбудителю вилта — грибу УеНісіШит йак- Иае.
Раскрытие этой стороны механизма защитных реакций хлопчатника позволило нам получить ряд данных для разработки методики диагносцирования устойчивости образцов хлопчатника к вилту. Кроме того, проведенное изучение позволило связать степень агрессивности штаммов гриба с активностью его пекто- литических ферментов. Эти данные представляют интерес не только для вилта хлопчатника, но и для всей группы болезней увядания.
Объектами исследований были 2 штамма: шестой, сильно агрессивный, черный, образующий микросклероции в массе, и первый, слабоагрессивный, белый, не образующий микросклероции. Мицелий гриба выращивали на среде Чапека-Докса с различными источниками углерода. Активность ферментов заметно варьировала на разных средах. Наименьшей активностью обладали грибы, выращенные на среде с глюкозой, наибольшей — грибы, выращенные на среде с пектином. Это дало нам основание отнести пектолптические ферменты гриба V. йаМіае к адаптивным ферментам.
Активность пектолитпческих ферментов — пектннэстеразы и полигалактуроназы — определяли в культуральной среде после удаления мицелия и в самом мицелии [1]. Мицелий гриба экстрагировали водой в течение 2 час. и из экстракта осаждали белок сернокислым аммонием, добавляя его до 0,7 от полного насыщения. Осадок отфильтровывали, растворяли в воде и пропускали через колонку с сефадексом С-50. Фракции элюата собирали порциями по 5 мл. Содержание белка во фракциях определяли спектрофотометрически по поглощению при 260—280 ммк. Аналогичным образом очпщалп и ферменты культуральной среды.
Об активности пектинметилэстеразы — фермента, отщепляющего метильные группы от пектина, — судили по увеличению кислотности после его инкубации с пектином. Для этого к пробе, содержащей фермент, 10 мл 1%-ного пектина п 2 мл 1 и. ЛаС1, добавляли 0,1 н. КОН до pH 5,2. Количество щелочи в миллилитрах служило мерой активности фермента. Активность полига- лактуроназы — фермента, расщепляющего цепочку полигалакту- роновой кислоты на отдельные фрагменты, определяли по приросту восстанавливающих сахаров, по уменьшению вязкости пектиновых растворов и по приросту галактуроновой кислоты. В последнем случае проводили хроматографическое отделение галактуроновой кислоты и ее количественное определение по реакции с хлористым трифенилтетразолием [2].
Активность пектолитических ферментов тесно связана со степенью агрессивности штамма: чем агрессивнее штамм, тем более активны пектолитические ферменты. Так, у агрессивного шестого штамма гриба активность пектинметилэстеразы в 1,5 раза выше, чем у менее агрессивного первого штамма. Полученные нами данные находятся в соответствии с данными Лила и сотрудников [3]. Эти авторы нашли, что пектолитические ферменты вырабатываются только патогенными штаммами V. dahliae и ни у одного из сапрофитных штаммов не обнаруживаются.
В наших опытах активность пектинметилэстеразы (в мл 0,1 н.
NaOH на 10 г пленки мицелия) составляла в мицелии 1,5, а в культуральной среде — 1,6. Активность полигалактуроназы (в мг моносахаров на 10 г пленки мицелия) была соответственно
  1. 16 и 0,17.

По-видимому, при культивировании гриба на жидкой среде устанавливается определенное равновесие между скоростью образования ферментов и их выделением в культуральную среду.
Погружение проростков хлопчатника в растворы ферментов приводило к их увяданию. Наиболее чувствительными оказались проростки в фазе семядольных листьев и молодые растения в фазе шестого-седьмого настоящего листа. Напротив, проростки в фазе первого-пятого настоящего листа отличаются повышенной устойчивостью к заражению и, как следствие этого, к увяданию в растворе пектолитических ферментов. Зависимость восприимчивости растения от возраста показана на рисунке. Эта зависимость прослежена на 145 сортах хлопчатника.
Скорость увядания в растворе фермента зависит от активности последнего: чем активнее пектолитические ферменты, тем скорее наступает увядание. С другой стороны, скорость увядания зависит и от степени устойчивости сорта: более устойчивые сорта увядают медленнее, менее устойчивые — быстрее. Характерно, что устойчивые растения, перенесенные из раствора фермента в воду, восстанавливают тургор тканей, тогда как неустойчивые сорта не восстанавливают. Эффект увядания вызывали не только пектолитические ферменты гриба V. dahliae, но и других возбудителей, например Fusarium oxysporum и F. uasinfectum.
Увядание растений хлопчатника при погружении их в растворы пектолитических ферментов, а также его отсутствие в рас- творах инактивированных ферментов свидетельствуют о том, что вертициллезное увядание тесно связано с действием пектолитпческих ферментов грпба. Подтверждением этого служат и полученные нами даті шло о появлении свободной галактуронпвой кислоты в растениях восприимчивых сортов после погружения в растворы эгах ферментов. В растениях устоилпвілх сортов галактуроновая кислота не образуется. Возможно, что фермент не проникает так глубоко в растение вследствие его ннактивпрова- НІ1Я тканями хлопчатника. Одним из механизмов такого ннакти- вирования может быть действие фенольных соединений.
Поражаемость хлопчатника вертицпллезным вилтом в онтогенезе
Рис. Поражаемость хлопчатника вертицпллезным вилтом в онтогенезе

  1. — семядоли; 2 — первый настоящий лист; з — второй на- стоящий лист; 4 — третий настоящий лист; «5 — четвертый настоящий лист; 6 — пятый настоящий лист; 7 — шестой-седьмой настоящий лист; 8 бутонизация; 0 — цветение

В ответ на внедрение гриба в растении хлопчатника происходит существенное изменение в составе и количестве фенольных соединений [4].
Количественное определение фенольных веществ проводили но методу Суэйна [5] с реактивом Фолина-Дениса. Для анализов использовались спиртовые вытяжки из тканей здоровых и зараженных растений. Заражение проводили в фазе семядолей. Экстракты готовили на четвертый день после заражения. Полученные результаты приведены в табл. 1.
Как видно из приведенных данных, наиболее высоким содержанием фенольных соединений характеризуются восприимчивые сорта, напротив, в устойчивых их содержание незначительно. По при заражении картина резко меняется. В восприимчивых сортах содержание фенольных соединений несколько понижается (на 25—30 %), у среднеустойчивых сортов почти не изменяется, а у устойчивых заметно возрастает.
Хроматографическое изучение этой группы соединений показало, что в тканях устойчивых сортов после заражения появ-

Содержание фенольных соединений в здоровых и зараженных растениях хлопчатника

Сорт

Степень
устойчивости

Оценка устойчивости при раинем заражении в “0 от количества учитываемых раст ений

Содержание фенолов в тканях в м.: " , на сырой лес

здоровых

больных

здоровых

загашенных

104Ф

Высокая

93

7

1 1

S0

113Ф

То же

100

0

17

74

103Ф

Средняя

37

вз

28

29

108Ф

То же

33

67

43

29

8190

Слабая

15

85

93

70

2034

То же

20

80

80

63


ляется ряд новых веществ, таких, как кофейная кпслота и вещество с -А/=0,53, имеющее характерное свечение (предположительно окопилпн). Инчересно, что хлорогеновая кислота, которая присутствует в тканях здоровых растений, в зараженных тканях устойчивых сортов исчезает, вероятно, вследствие окисления и расщепления, о чем свидетельствует факт появления кофейной кислоты.
Присутствие этих соединений, обладающих яркой флуоресценцией, объясняет свечение жилок у зараженных внлтом растений хлопчатника. Это свечение наблюдается преимущественно у устойчивых сортов.
Наличие ряда фенольных соединений в зараженных тканях хлопчатника дало основание испытать их действие на рост возбудителя внлта в искусственной культуре. Было изучено влияние хлорогеновой и кофейной кислот п продуктов нх окисления. Окисление осуществлялось препаратом полнфенолоксттдазы. Определялись рост грпба (по весу мицелия) и активность пектолити- ческнх ферментов, выделяемых в культуральную среду. Полученные данные представлены в табл. 2.
Наиболее токсичной оказалась кофейная кпслота, которая в концентрации 0,1 мг/мл полностью подавляла рост гриба. Хло- рогеновая кислота в концентрации 2 мг/мл значительно стимулировала рост гриба, а в концентрации 0,1 мг/мл практически на него не влияла. Аналогичные данные по влиянию хлорогеновой кислоты на рост гриба Phytophthora infestans были получены
В.              Е. Соколовой и сотр. [6]. Стимулирующее действие хлорогеновой кислоты на рост грибов связано с присутствием в ее молекуле остатка хинной кислоты, являющейся, как известно, хорошим субстратом для роста грибов. Хлорогеновая кислота
Влияние фенольных соединений на рост V. с1а11/нк' и активность его пектолитических ферментов

Фенольные соединения

Концентрация (в .«lt;5 лис культуральной Среды)

Пег мицелия (в г)

\ К'! ц [
ІІС'КЇЇШМеШЛ- эстеразы (в дм 0,1 н. ХаОН)

iu.fi
шпи гилик- туронаиы (в мг моно- гахарон)

Контроль (вода) . . .


и

0,46

0,6

Кофейная кислота . .

ОД

Роста нет



Хлорогеновая кислота

2.0

2,35

0/іЯ

0,70


0,1

0,Н5


0,44


од -ь пфо

0,03

од

ОД 8


в концентрации 0,1 мг/мл, предварительно окисленная иолпфе- нолоксидазой, очень сильно подавляла рост гриба и активность, ьыделяемых им пектолитических ферментов. По-видимому, это. связано с денатурирующим действием окисленных фенольных соединений на белки. В наших опытах активность обоих пектолитических ферментов понижалась в 3—5 раз.
Есть все основания предполагать, что подобным же образом могут действовать окисленные производные хлорогеновой кислоты и в тканях зараженных растений хлопчатника. Эти окисленные продукты связывают пектолитические ферменты патогена и тем. самым препятствуют его распространению по тканям растения.
На основании проведенного изучения взаимоотношении возбудителя вертпциллезного увядания и растения-хозяина хлопчатника нами были предложены и апробированы на коллекции ВИРа два следующих метода.
  1. Определение степени устойчивости образцов по их способности активировать синтез фенольных соединений. 2. Определение степени увядания хлопчатника в пектолитических ферментах гриба (культуральной среде) с учетом обратимости увядания после помещения увядших всходов в воду. Оба метода применимы для оценки устойчивости растений в фазе 6—7'го настоящего листа.

Предложенными методами было оценено более 300 сортов хлопчатника отечественной и зарубежной селекции, полученных из коллекции ВИРа. Из сортов вида Соэзуртт ЫгвШит выделена небольшая группа — 19 относительно устойчивых сортов. Это сорта американской группы Акала, ряд угандских форм, несколько образцов из Центральной Америки п некоторые отечественные сорта (108Ф н др.). Они могут служить основой для селекции хлопчатника на устойчивость к вплту.
  1. Е. Г. Салькова, H. Н. Гусева. Пентолитические ферменты возбуди

теля вертпдпллезпого увядания хлопчатника. — Докл. АН СССР, 163, Ж 2, 1965.
  1. Е. Г. С а л ь к о в а, Н го К э - с ы о н г. Пентолитические ферменты грибов,

вызывающих загнивание плодов. — Докл. АН СССР, 161, № 1. 1965.
  1. J. A. L е а 1, J. R. V i 11 a n u е V a. Lack of pectic enzyme production of non-

pathogenic species of Verticillium. — Nature, 195, 1962.
  1. Б. A. P у б и н. JI. М. Перевязк и н а. Роль дубильных веществ в явле

ниях устойчивости хлопчатника к вплту. — Докл. АН СССР, 79, № 2, 1951.
  1. Т. Swain, W. E. Н i 11 i s. The phenolic constituents of Prunus domestica.
  1. The quantitave analysis of phenolic constituents. — J. Sei. Food and Agric., 10, 1943.
  1. В. E. Соколова, О. H. Савельева, В. А. Рубин. Характер превра

щения хлорогеновой кислоты в клубнях картофеля, пораженных Phytophthora infestans. — Докл. АН СССР, 123, № 2. 1958.

<< | >>
Источник: Метлицкий Л.В. (ред). Биохимические основы защиты растений. 1966

Еще по теме ИЗУЧЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ УСТОЙЧИВОСТИ ХЛОПЧАТНИКА К ВОЗБУДИТЕЛЮ ВЕРТПЦИЛЛЕЗНОГО УВЯДАНИЯ:

  1. ОПЫТ БИОХИМИЧЕСКОГО ОТБОРА КАПУСТЫ НА ПОВЫШЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ К BOTRYTIS CIУ ЕЛЕ А PERS.
  2. БИОХИМИЧЕСКАЯ ПРИРОДА РАНЕВЫХ РЕАКЦИИ РАСТЕНИЙ И ИХ РЕГУЛИРОВАНИЕ
  3. БИОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ СОЗРЕВАНИЯ ПЛОДОВ
  4. БИОХИМИЯ УСТОЙЧИВОСТИ КАРТОФЕЛЯ К ВОЗБУДИТЕЛЮ РАКА 8ТЖСН\ ТШим ЕЛгПОВЮТ1Сим (ЭСШЬВ.) РЕЙС.
  5. ТОКСИНЫ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ТРАХЕОМИКОЗНЫХ БОЛЕЗНЕЙ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ДЕЙСТВИЯ НА ПРИМЕРЕ МАЛЬСЕККО ЦИТРУСОВЫХ
  6. Первые успехи в изучении природы биокаталитических реакций. Открытие специфичности действия ферментов
  7. УДОБРЕНИЕ ХЛОПЧАТНИКА
  8. ВЕРТИЦИЛЛИОЗНОЕ УВЯДАНИЕ (УегИсШшт аШо-Мгит Нет. е1 ВегНгьо.
  9. 9.8. БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ И ИХ ИЗМЕНЧИВОСТЬ
  10. 6.4.3.7. Биохимический метод
  11. РОЛЬ ПИТАНИЯ В БИОХИМИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ РАС ФИТОФТОРЫ КАРТОФЕЛЯ
  12. БИОХИМИЧЕСКАЯ ИНТЕРПРЕТАЦИЯ ЭВОЛЮЦИИ ПАРАЗИТИЗМА